一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法，包括(1)将一定量O‑羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；(2)采用纺丝液进行静电纺丝，得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；(3)将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化；(4)活化的纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子EGF和CoCl

A preparation method of surface grafted recombinant epidermal growth factor nanofibers

【技术实现步骤摘要】
一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法
本专利技术涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法。
技术介绍
羧甲基壳聚糖及其多种衍生物均具有不同程度的抗感染作用。小分子的脱乙酰壳聚糖具有质子化铵，质子化铵与细菌带负电荷的细胞膜作用，吸附和聚沉细菌，同时穿透细胞壁进入细胞内，扰乱细菌的新陈代谢及合成而具有抗菌作用。相对分子量为1500的脱乙酰壳聚糖对大肠杆菌的抑制效果最强，随着分子量增大，则抑菌作用下降。脱乙酰壳聚糖对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、小肠结尖耶尔氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和李斯特单核增生菌，均有较强的抑制作用。羧甲基壳聚糖已被制成无纺布、流延膜、涂层纱布等多种医用敷料用于临床，其中羧甲基壳聚糖与醋酸制成的无纺布透气透水性能极佳，用于大面积烧伤烫伤，抗感染和促进伤口愈合效果很好。1975年首次从人尿液中提取得到人表皮生长因子。90年代采用生物工程技术基因重组，即通过选择生产菌株，进行工程菌发酵，再经纯化、冻干后制得重组人表皮生长因子。重组表皮生长因子可以促进细胞有丝分裂以及糖、蛋白质、DNA、RNA合成，具有促进上皮细胞分裂增殖的作用，在临床应用上与免疫性皮肤病、创面组织修复和手术血管愈合的治疗密切相关。临床上应用精制的重组人表皮生长因子，可以促进创面愈合，配合常规烧伤创面处理，对烧伤浅II度、深II度(尤其是后者)慢性创面、供皮区等均具有不同程度的加速愈合的作用，可缩短患者住院时间。目前，有文献报道，将重组人表皮生长因子做成水凝胶、水溶液、普通乳剂等剂型，但是由于重组人表皮生长因子分子量较大，这些剂型中的重组人表皮生长因子稳定性差，并且分散基质无明显的吸收促进作用，造成制剂透皮效果不佳，有效成分的吸收利用度很低，特别是手术血管接合有较大难度。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，本专利技术将表皮生长因子接枝在O-羧甲基壳聚糖纳米纤维上，得到的纳米纤维能够更好地促进角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：S1：将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；S3：将所述O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化，得活化纳米纤维；S4：将步骤S3得到的活化纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子和CoCl2的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干后得到表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。优选的，所述O-羧甲基壳聚糖粘均分子量为5.0×105，脱乙酰度为80～85％，所述聚氧化乙烯的平均分子量为1.0×106。优选的，步骤S1中，O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度为10～30g/L，O-羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1～4。优选的，步骤S2中，所述静电纺丝工艺中，注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针，电压12～20KV，距离7～10cm，进样速率0.3～1.0ml/h，温度25～35℃。优选的，步骤S3中，所述烘干的温度为37～45℃，烘干时间为2～4h。优选的，步骤S3中，等离子体处理器处理的条件为：气体采用氮气或氧气，处理功率为250～300W，压强50～60Pa，处理时间为10～15min。优选的，步骤S4中，所述含有重组表皮生长因子和CoCl2的DMEM培养基中重组表皮生长因子的浓度为40～80mg/L，CoCl2的浓度为0.15～0.30g/L。优选的，步骤S4中，接枝反应的浸泡浴比为1:100～300，浸泡温度为0～4℃，浸泡时间为12～24h。优选的，步骤S4中，所述负压闪爆的真空度为0.100～0.024mBar，所述冻干的温度为-30～-20℃，真空度为0.100～0.024mBar，冻干时间为3～5d。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1)采用O-羧甲基壳聚糖，该高分子化合物具有游离的羧基和氨基，水溶性和生物相容性比壳聚糖更佳。其丰富的羧基和氨基能够为蛋白分子的锚定提供多锚定位点，增强结合强度。2)采用O-羧甲基壳聚糖螯合Co2+离子，在细胞修复处产生化学低氧环境，诱导细胞内低氧诱导因子HIF的表达升高，通过转录因子调控诱导上皮及表皮生长。附图说明图1是本专利技术实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的生长情况；图2是本专利技术实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的细胞增殖率。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制。本专利技术所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。本专利技术采用的技术方案如下：一种表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：S1：将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；S2：采用纺丝液进行静电纺丝，得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；S3：将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化；S4：将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子EGF的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应；S5：将完成接枝反应的纳米纤维离心冻干。步骤S1中，所用O-羧甲基壳聚糖的规格为粘均分子量5.0×105，脱乙酰度优选为80～85％，更优选为80％。所用聚氧化乙烯的规格为平均分子量1.0×106。O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L，O-羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比优选为1:1～4，更优选为1:3。步骤S2中，静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压优选为12～20KV，更优选为15KV，距离优选为7～10cm，更优选为8cm，进样速率优选为0.3～1.0ml/h，更优选为0.5ml/h，温度优选为25～35℃，更优选为30℃。步骤S3中，洗涤终点pH为7，烘干的温度优选为37～45℃，更优选为37℃，烘干时间优选为2～4h，更优选为4h。等离子体处理的条件为：气体优选采用氮气或氧气，更优选为氧气，处理功率优选为250～300W，更优选为280W，压强优选为50～60Pa，更优选为55Pa，处理时间优选为10～15min，更优选为15min。步骤S4中，所述的表皮生长因子EGF的浓度优选为40～80mg/L，更优选为80mg/L，CoCl2的浓度优选为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1：将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；/nS2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；/nS3：将所述O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化，得活化纳米纤维；/nS4：将步骤S3得到的活化纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子和CoCl

【技术特征摘要】
1.一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3：将所述O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化，得活化纳米纤维；
S4：将步骤S3得到的活化纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子和CoCl2的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干后得到表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。


2.根据权利要求1所述的一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述O-羧甲基壳聚糖粘均分子量为5.0×105，脱乙酰度为80～85％，所述聚氧化乙烯的平均分子量为1.0×106。


3.根据权利要求1所述的一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S1中，O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度为10～30g/L，O-羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1～4。


4.根据权利要求1所述的一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述静电纺丝工艺中，注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针，电压12～2...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤佳鹏，葛彦，操维芳，朱俐，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32