一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法技术

本发明专利技术公开了前列腺癌领域的一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法。本发明专利技术通过直接从人体尿液中提取外泌体，并通过测定外泌体中PCA3、ERG基以及SPDEF的含量，鉴定是否患有前列腺癌，其比采取PCA3/PSA的尿液检测试剂盒鉴定结果的准确率高，且只需使用普通的PCR仪器，就可完成检测，不需另外购置设备。

An analysis method of prostate cancer based on urinary exosomes

【技术实现步骤摘要】
一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法
本专利技术涉及前列腺癌领域，具体为一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法。
技术介绍
前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，随着我国人口老龄化的到来，前列腺癌发病率逐年上升，严重威胁老年男性的生命健康。目前，医学鉴定是否患有前列腺癌，主要通过穿刺活检，检测患者前列腺特异性抗原(PSA)的含量。PSA具有良好的前列腺组织特异性，但缺乏足够的前列腺癌特异性，在前列腺增生和前列腺炎的患者中，PSA的水平也会升高，导致一系列前列腺癌穿刺鉴定为阴性结果，增加患者的医疗费用和心里负担。目前，市场上出现基于PCA3(前列腺癌抗原3)/PSA的尿液检测试剂盒，应用转录介导的扩增(TMA)方法给出PCA3/PSA在尿液中的浓度(copy/mL)，然后二者相比后乘以1000即为前列腺癌风险评估值。该方法虽然提高前列腺癌预示诊断结果的准确度，且不必通过穿刺活检，降低患者的心里负担，但是该质控及结果准确率较低，复检率较高，与临床常规PCR仪器不兼容，需另外购置设备。目前，研究发现PCA3、ERG基因以及SPDEF基因(含SAM指向结构域的ETS转录因子)在前列腺癌中高度表达并具有代表性的肿瘤标志物，因此可通过检测尿液中PCA3、ERG与SPDEF的含量，判定是否患有前列腺癌。基于此，本专利技术设计了一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，包括如下步骤：S1、收集患者初始阶段尿液10～15mL，在2～6℃、2000～2500rpm离心5～10min，弃上清液，在底部沉淀内加入1.0～1.5mLPBS溶液并反复吹打混匀，得到混合外泌体溶液；S2、向S1中外泌体溶液加入1.0～1.5mLTrizol溶液，静置3～5min后，加入0.2～0.7mL氯仿，颠倒混匀，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液通过多次离心，得到样品RNA溶液；S3、分别取阳性质控品、阴性质控品和S2中的样品RNA溶液各5～8μL，并分别与RT-PCR扩增试剂(该RT-PCR扩增试剂包PSA、PCA3、ERG以及SPDEF的特异引物和探针)进行扩增，分别得到阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物(其中，阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物中均包含有PSA-mRNA、PCA3-mRNA、ERG-mRNA以及SPDEF-mRNA)；S4、分别对S3中的阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物进行验证测序，并分别计算阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物中的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分；S5、分别对阳性质控品PCR产物与阴性质控品PCR产物的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分进行评判，若阳性质控品PCR产物的PCA3评分在56.4～60.3、ERG评分在60.2～65.4以及SPDEF评分在57.8～62.6之间，且阴性质控品PCR产物的PCA3评分在18.5～22.6、ERG评分在20.8～26.2以及SPDEF评分在19.4～24.7之间，则可进行下一步判断，若其中任何一项数值不在区间范围内，则从S3重新进行操作；S6、对样品PCR产物的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分进行评判，若同时满足PCA3评分≧56.4、ERG评分≧60.2以及SPDEF评分≧57.8，则可判定该患者患有前列腺癌(准确率大于90％)。更进一步地，所述S1中PBS的pH为7.2～7.4。更进一步地，所述S2中多次离心具体操作步骤如下：a、在上层澄清溶液中加入0.5～0.8mL异丙醇，摇晃均匀后，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，弃上清液，底部沉淀记为一次沉淀；b、将一次沉淀加入1.0～1.5mL乙醇溶液中，摇晃均匀后，在2～6℃、7000～8000rpm离心3～5min，弃上清液，底部沉淀记为二次沉淀；c、将二次沉淀溶于0.1～0.2mLDEPC水中，得到总RNA溶液。更进一步地，所述b中乙醇溶液采用无水乙醇与DEPC水配置，且b中乙醇溶液浓度为70～80％。更进一步地，所述S3中阳性质控品选自前列腺癌细胞株5μL总RNA逆转录后的cDNA。更进一步地，所述S3中阴性质控品选自正常前列腺细胞株5μL总RNA逆转录后的cDNA。更进一步地，所述S3中步骤扩增步骤如下：e、在PCR仪中，先36～40℃，扩增3～5min，再40～60℃，扩增10～20min，再90～95℃，扩增1～2min，再50～60℃，扩增0.5～2min；f、按照e步骤，将e中得到的PCR产物继续在PCR仪中进行40～50个循环；g、将f得到的PCR产物在40～50℃冷却0.5～2min。更进一步地，所述S4中PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分计算公式如下：PCA3评＝(PCA3-mRNAcoples)/(PSA-mRNAcoples)×1000；ERG评分＝(ERG-mRNAcoples)/(PSA-mRNAcoples)×1000；SPDEF评分＝(SPDEF-mRNAcoples)/(PSA-mRNAcoples)×1000。采用上述的技术方案，本专利技术达到的有益效果是：通过直接从人体尿液中提取外泌体，并通过测定外泌体中PCA3、ERG基以及SPDEF的含量，鉴定是否患有前列腺癌，其比采取PCA3/PSA的尿液检测试剂盒鉴定结果的准确率高，且只需使用普通的PCR仪器，就可完成检测，不需另外购置设备。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，包括如下步骤：S1、收集患者初始阶段尿液10mL，在4℃、2500rpm离心5min，弃上清液，在底部沉淀内加入1.0mLPBS溶液并反复吹打混匀，得到混合外泌体溶液；S2、向S1中外泌体溶液加入1.3mLTrizol溶液，静置3min后，加入0.2mL氯仿，颠倒混匀，在2℃、12000rpm离心13min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液通过多次离心，得到样品RNA溶液；S3、分别取阳性质控品、阴性质控品和S2中的样品RNA溶液各5μL，并分别与RT-PCR扩增试剂(该RT-PCR扩增试剂包PSA、PCA3、ERG以及SPDEF的特异引物和探本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1、收集患者初始阶段尿液10～15mL，在2～6℃、2000～2500rpm离心5～10min，弃上清液，在底部沉淀内加入1.0～1.5mLPBS溶液并反复吹打混匀，得到混合外泌体溶液；/nS2、向S1中外泌体溶液加入1.0～1.5mL Trizol溶液，静置3～5min后，加入0.2～0.7mL氯仿，颠倒混匀，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液通过多次离心，得到样品RNA溶液；/nS3、分别取阳性质控品、阴性质控品和S2中的样品RNA溶液各5～8μL，并分别与RT-PCR扩增试剂(该RT-PCR扩增试剂包PSA、PCA3、ERG以及SPDEF的特异引物和探针)进行扩增，分别得到阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物(其中，阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物中均包含有PSA-mRNA、PCA3-mRNA、ERG-mRNA以及SPDEF-mRNA)；/nS4、分别对S3中的阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物进行验证测序，并分别计算阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物中的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分；/nS5、分别对阳性质控品PCR产物与阴性质控品PCR产物的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分进行评判，若阳性质控品PCR产物的PCA3评分在56.4～60.3、ERG评分在60.2～65.4以及SPDEF评分在57.8～62.6之间，且阴性质控品PCR产物的PCA3评分在18.5～22.6、ERG评分在20.8～26.2以及SPDEF评分在19.4～24.7之间，则可进行下一步判断，若其中任何一项数值不在区间范围内，则从S3重新进行操作；/nS6、对样品PCR产物的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分进行评判，若同时满足PCA3评分≧56.4、ERG评分≧60.2以及SPDEF评分≧57.8，则可判定该患者患有前列腺癌(准确率大于90％)。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、收集患者初始阶段尿液10～15mL，在2～6℃、2000～2500rpm离心5～10min，弃上清液，在底部沉淀内加入1.0～1.5mLPBS溶液并反复吹打混匀，得到混合外泌体溶液；
S2、向S1中外泌体溶液加入1.0～1.5mLTrizol溶液，静置3～5min后，加入0.2～0.7mL氯仿，颠倒混匀，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液通过多次离心，得到样品RNA溶液；
S3、分别取阳性质控品、阴性质控品和S2中的样品RNA溶液各5～8μL，并分别与RT-PCR扩增试剂(该RT-PCR扩增试剂包PSA、PCA3、ERG以及SPDEF的特异引物和探针)进行扩增，分别得到阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物(其中，阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物中均包含有PSA-mRNA、PCA3-mRNA、ERG-mRNA以及SPDEF-mRNA)；
S4、分别对S3中的阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物进行验证测序，并分别计算阳性质控品PCR产物、阴性质控品PCR产物以及样品PCR产物中的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分；
S5、分别对阳性质控品PCR产物与阴性质控品PCR产物的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分进行评判，若阳性质控品PCR产物的PCA3评分在56.4～60.3、ERG评分在60.2～65.4以及SPDEF评分在57.8～62.6之间，且阴性质控品PCR产物的PCA3评分在18.5～22.6、ERG评分在20.8～26.2以及SPDEF评分在19.4～24.7之间，则可进行下一步判断，若其中任何一项数值不在区间范围内，则从S3重新进行操作；
S6、对样品PCR产物的PCA3评分、ERG评分和SPDEF评分进行评判，若同时满足PCA3评分≧56.4、ERG评分≧60.2以及SPDEF评分≧57.8，则可判定该患者患有前列腺癌(准确率大于90％)。


2.根据权利要求1所述的一种基于尿液外泌体鉴定前列腺癌的分析方法，其特征在于：所述S1中PBS的pH为7.2～7.4。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，
申请(专利权)人：赵凯，
类型：发明
国别省市：山东;37