用于检测生物组分的方法和系统技术方案

提供了用于检测来自生物样本的组分的方法。在某些方面，所述方法可用于检测和/或定量生物样本如肿瘤细胞(例如，循环肿瘤细胞)中的特定组分。还提供了用于实施本主题方法的系统和装置。

Methods and systems for the detection of biological components

【技术实现步骤摘要】
用于检测生物组分的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求2012年8月13日提交的美国临时申请号61/682,707和2013年3月14日提交的美国临时申请号61/784,754的优先权，所述申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。介绍来自受试者的生物样本通常含有多种不同的组分。例如，受试者的血液样本可含有自由浮动的DNA和RNA、循环细胞和许多其它组分。生物样本中的这些组分的数目和多样性通常复杂化或阻止所述样本内目标特定组分的精确鉴定和/或定量，所述精确鉴定和/或定量将使得能够诊断或监测受试者中的病状，例如癌症。例如，循环肿瘤细胞(CTC)是从进入受试者的血流中的肿瘤脱落的细胞。一旦进入血液中，这些细胞就可以在受试者的身体中循环，在受试者的身体中它们可以侵入其它组织并生长新的肿瘤。因此CTC与转移有关联，这是癌症受试者死亡的主要原因。对CTC进行计数的努力受到CTC极其难以检测的事实的阻碍：它们非常罕见，并且可能难以与健康细胞相区分。目前用于检测CTC的方法依赖于免疫测定，其中使用抗体来靶向CTC表面上的特定生物标志物。然而，这些方法在灵敏度和/或特异性方面存在限制，导致许多健康细胞被错误表征为癌性，并且许多癌细胞在分析中被遗漏。概述提供了用于检测来自生物样本的组分的方法。在某些方面，所述方法可用于检测和/或定量生物样本中的特定组分，如肿瘤细胞(例如，循环肿瘤细胞或CTC)。还提供了用于实施本专利技术的方法的系统和装置。本公开的方法包括用于检测生物样本中的细胞，例如肿瘤细胞的方法。使用微流体学，可将生物样本的组分封装到微滴中，所述微滴是直径范围一般为0.1至1000μm的溶液的微小球体，其可用于封装细胞、多核苷酸、多肽和其它组分。封装在每个微滴中的组分可如本文更充分描述来测定。所述方法的方面可包括将获自受试者的血液样本的细胞封装在微滴中，其中在所述微滴中存在至少一个细胞；裂解所述细胞；将聚合酶链式反应(PCR)试剂、检测组分和多个PCR引物引入所述微滴中并在允许PCR扩增的条件下孵育所述微滴以产生PCR扩增产物，其中所述多个PCR引物包括与一种或多种寡核苷酸(例如，致癌基因)杂交的一个或多个引物；以及通过所述检测组分的检测来检测所述PCR扩增产物的存在或不存在，其中检测到所述检测组分指示PCR扩增产物的存在。在某些方面，裂解细胞的步骤包括将裂解剂引入所述微滴中并且在有效使细胞裂解的条件下孵育所述微滴。所述方法可包括至少部分地基于其中检测到PCR产物的微滴的数目，确定受试者的血液样本中存在的循环肿瘤细胞(CTC)的数目。在其它方面，所述方法可包括至少部分地基于其中检测到PCR产物的微滴的数目，确定来自受试者的固体组织样本中存在的肿瘤细胞的数目。在其它方面，用于检测细胞的方法包括在其中大多数微滴含有零或一个细胞的条件下将多个细胞封装在多个微滴中，其中所述多个细胞获自受试者的血液样本；使所述多个微滴富集含有一个细胞的微滴；裂解所述细胞；将聚合酶链式反应(PCR)试剂、检测组分和多个PCR引物引入所述多个微滴中并在允许PCR扩增的条件下孵育所述多个微滴以产生PCR扩增产物，其中所述多个PCR引物包括各自与一种或多种寡核苷酸(例如，致癌基因)杂交的一个或多个引物；通过所述检测组分的检测来检测所述PCR扩增产物的存在或不存在，其中检测到所述检测组分指示所述PCR扩增产物的存在；以及至少部分地基于其中检测到所述PCR扩增产物的微滴的数目来确定受试者的血液样本中存在的细胞数目；其中一个或多个步骤是在微流体控制下进行的。在某些方面，所述细胞是肿瘤细胞，并且所述多个PCR引物包括各自与一种或多种致癌基因杂交的一个或多个引物。裂解所述细胞的步骤可包括将裂解剂引入所述微滴中并且在有效使细胞裂解的条件下孵育所述微滴。本公开的方法还包括用于对细胞(包括肿瘤细胞)进行基因分型的方法。在某些方面，用于对细胞进行基因分型的方法包括将获自受试者的生物样本的细胞封装在微滴中，其中所述微滴中存在一个细胞；将裂解剂引入所述微滴中并且在有效使细胞裂解的条件下孵育所述微滴；将聚合酶链式反应(PCR)试剂和多个PCR引物引入所述微滴中，并在允许PCR扩增的条件下孵育所述微滴以产生PCR扩增产物；将多个探针引入所述微滴中，其中所述探针与一种或多种目标突变杂交并在不同波长下发荧光；以及通过探针荧光的检测来检测特定PCR扩增产物的存在或不存在，其中检测到荧光指示所述PCR扩增产物的存在；其中一个或多个步骤在微流体控制下进行。所述多个探针可包括一个或多个探针。本公开的方法还包括用于检测癌症的方法，所述方法包括将获自受试者的生物样本的寡核苷酸封装在微滴中，其中所述微滴中存在至少一种寡核苷酸；将聚合酶链式反应(PCR)试剂、检测组分和多个PCR引物引入所述微滴中并在允许PCR扩增的条件下孵育所述微滴以产生PCR扩增产物，其中所述多个PCR引物包括各自与一种或多种致癌基因杂交的一个或多个引物；以及通过所述检测组分的检测来检测所述PCR扩增产物的存在或不存在，其中检测到所述检测组分指示所述PCR扩增产物的存在。受试者中的癌症的检测可能基于一种或多种致癌基因的PCR扩增产物的存在。在其它方面，本公开的方法包括将获自受试者的生物样本的寡核苷酸封装在微滴中，其中所述微滴中存在至少一种寡核苷酸；将聚合酶链式反应(PCR)试剂、检测组分和多个PCR引物引入所述微滴中并在允许PCR扩增的条件下孵育所述微滴以产生PCR扩增产物；以及通过所述检测组分的检测来检测所述PCR扩增产物的存在或不存在，其中检测到所述检测组分指示PCR扩增产物的存在；其中一个或多个步骤在微流体控制下进行。在实施主题方法时，可采用若干变型。例如，可采用范围广泛的不同的基于PCR的测定，例如定量PCR(qPCR)。这些测定中使用的引物的数目和性质可至少部分地基于所进行测定的类型、生物样本的性质和/或其它因素而改变。在某些方面，可加入微滴中的引物的数目可为1至100个或更多，和/或可包括用于检测约1至100种或更多不同的基因(例如，致癌基因)的引物。除了这些引物之外或代替这些引物，在实施主题方法时可采用一个或多个探针(例如，探针)。所述微滴本身可能变化，包括尺寸、组成、内含物等。微滴一般可具有约0.001至1000皮升或更大的内部容积。此外，微滴可能被或可能未被表面活性剂和/或粒子稳定化。将试剂加入微滴的方法可能极大地变化。试剂可在一个步骤或在多个步骤中加入，例如2个或更多的步骤、4个或更多的步骤或10个或更多的步骤。在某些方面，可使用包括小滴聚结、皮可注射(picoinjection)、多小滴聚结等技术来加入试剂，如本文将更充分描述。在某些实施方案中，通过其中注射流体本身充当电极的方法来加入试剂。所述注射流体可含有一种或多种类型的允许其原样使用的溶解电解质。在注射流体本身充当电极时，可消除出于向小滴中加入试剂的目的而对于微流体芯片中的金属电极的需要。在某些实施方案中，注射流体不充当电极，而是利用一种或多种液体电极来代替金属电极。使用多种不同的检测组分，可采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：/n(a)在液滴中从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物并在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；/n(b)灭活所述蛋白酶；/n(c)向所述液滴中直接皮可注射试剂，所述试剂用于进行核酸扩增反应以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及/n(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；/n其中，在步骤(d)之前不从所述裂解液滴或从所述扩增液滴中选择性除去试剂。/n

【技术特征摘要】
20120813 US 61/682,707;20130314 US 61/784,7541.一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在液滴中从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物并在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；
(b)灭活所述蛋白酶；
(c)向所述液滴中直接皮可注射试剂，所述试剂用于进行核酸扩增反应以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及
(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；
其中，在步骤(d)之前不从所述裂解液滴或从所述扩增液滴中选择性除去试剂。


2.一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在液滴中使用蛋白酶从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；
(b)灭活所述蛋白酶；
(c)向所述液滴中皮可注射试剂用于进行核酸扩增反应以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及
(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；其中，步骤(a)的所述蛋白酶在步骤(c)之前是灭活的。


3.如权利要求1或2所述的方法，所述扩增液滴的体积是0.001至1000皮升。


4.如权利要求3所述的方法，所述扩增液滴的直径是0.1微米至1000微米。


5.如权利要求1或2所述的方法，所述含有多核苷酸的组分是细胞、病毒或孢子。


6.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(c)包括(i)将所述裂解液滴与包含所述用于进行核酸扩增反应的试剂的流体流融合，以及(ii)从所述流体流形成所述扩增液滴。


7.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过液滴聚结将所述用于进行核酸扩增反应的试剂添加至所述裂解液滴。


8.如权利要求5所述的方法，所述裂解液滴含有单细胞裂解物。


9.如权利要求1或2所述的方法，所述一种或多种目标多核苷酸是DNA。


10.如权利要求1或2所述的方法，所述一种或多种目标多核苷酸是RNA。


11.如权利要求10所述的方法，其中，扩增包括逆转录以生成逆...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·R·阿贝特，D·J·伊斯特本，A·R·夏穆比，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US