一种双链DNA结合荧光染料及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双链DNA结合荧光染料，该染料包含有式ⅰ所示结构或其立体异构体。本发明专利技术还公开了上述染料的制备方法及用途。本发明专利技术通过叔胺连接两个荧光团，且荧光团易于π‑π堆积错位，降低两个分子结合前的荧光强度，获得更强的扩增信号，从而提高了双链DNA结合荧光染料的灵敏性和稳定性，降低了其细胞毒性和对PCR的抑制性。

A double stranded DNA binding fluorescent dye and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种双链DNA结合荧光染料及其制备与应用
本专利技术涉及核酸染料领域，特别是涉及一种新型的双链DNA结合荧光染料。
技术介绍
双链DNA（dsDNA）结合荧光染料中最具代表性的是分子溴化乙锭，其早已用于琼脂糖凝胶电泳中的核酸染色。双链DNA结合荧光染料同样应用于检测核酸的实时扩增，例如PCR。对应的扩增产物可以通过DNA结合荧光染料予以识别，当该染料和双链核酸相互作用后，再用适宜的波长激发，可以发射相应的荧光信号。在PCR反应过程中，待测样品中只要存在双链的DNA，染料就可以选择性的结合，同时可以检测到荧光信号。当双链DNA解离时，信号会迅速降低。这种信号的衰减同样适合于荧光强度对温度-时间曲线的监测。双链DNA结合荧光染料还可用于实时PCR的检测。此时，最经常使用的荧光染料是SYBRGreenI。SYBRGreenI因为其高效低毒得到广泛的应用，但是由于其本身不能用于普通的PCR缓冲液，需要添加DMSO、DBA等额外试剂；同时，虽然可以通过增加MgCl2的浓度降低其PCR抑制效应，但是浓度依赖的抑制效果依然存在，因此SYBRGreenI在多重PCR应用中受限。研究发现，当进行双重PCR扩增时，只能检测到一个产物的溶解曲线，但是电泳分析却明确显示含有两个产物。因此，尽管SYBRGreenI应用范围较广，但仍存在可用浓度范围小、序列结合偏差性大等缺点。此外，现有的多种核酸染料本身具有较高的毒性，这主要是由于染料分子可以轻易地穿透细胞膜，从而和细胞内的核酸DNA结合，导致基因突变，具有一定的致癌性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种双链DNA结合荧光染料，它灵敏性和稳定性好，细胞毒性低，对PCR的抑制性小。为解决上述技术问题，本专利技术的双链DNA结合荧光染料，其分子结构中包含有式ⅰ所示的结构或其立体异构体：（ⅰ）较佳的，所述荧光染料的分子结构式优选为：其中，X为卤素，例如Br或I。所述式ⅰ的立体异构体主要为ZE异构：（ⅲ）（ⅳ）本专利技术要解决的技术问题之二是提供上述双链DNA结合荧光染料的制备方法。该方法主要包括以下步骤：1）2-甲基苯并噻唑与1,2-二碘乙烷反应获得中间体I：2）中间体I与甲胺反应获得中间体Ⅱ：3）中间体Ⅱ与对氨基苯甲醛反应获得式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料：。上述步骤1）中的原料1,2-二碘乙烷也可以选用其他邻二卤代乙烷替代，例如1,2-二溴乙烷。上述步骤2）优选采用封管反应法，反应体系中可以添加缚酸剂，所述缚酸剂可以选用二异丙基乙胺，添加量优选为1.5当量。上述步骤3）的反应优选采用乙酸和哌啶的混合液作为催化体系，乙酸和哌啶的体积比优选为1:1～1:4。本专利技术要解决的技术问题之三是提供上述双链DNA结合荧光染料的用途，该双链DNA结合荧光染料可用于核酸的实时定量PCR检测。本专利技术的双链DNA结合荧光染料，通过叔胺连接两个荧光团，且荧光团中的N,N'-二甲基苯易于形成强烈的π-π堆积，从而形成类分子簇的结构，导致该染料本身的荧光强度降低；当该染料和核酸结合以后，由于苯并噻唑和N,N'-二甲基苯的双键连接臂易于受到核酸结构的限制而固定，导致整个荧光团结构的刚性化，便于形成共轭，从而可以获得更强的扩增信号，提高双链DNA结合荧光染料的灵敏性和稳定性，同时降低其细胞毒性和对PCR的抑制性。另外，本专利技术的双链DNA结合荧光染料可以直接用于普通的PCR缓冲液，不需要添加DMSO、DBA等额外试剂。附图说明图1为本专利技术实施例1的中间体Ⅱ的核磁共振谱图；图2为本专利技术实施例1的最终产物（式Ⅲ化合物）的核磁共振谱图；图3～图6为本专利技术实施例1制备的式Ⅲ化合物用于实时荧光定量PCR的扩增曲线结果图；图7为使用对比试剂SYBR的实时荧光定量PCR扩增曲线结果图；图8～图11为本专利技术实施例1制备的式Ⅲ化合物用于PCR定量的标准曲线结果图；图12为使用对比试剂SYBR的PCR定量的标准曲线结果图。图13为对照品EB用于琼脂糖凝胶电泳结果图；图14为对照品GelRed用于琼脂糖凝胶电泳结果图；图15为本专利技术实施例1制备的式Ⅲ化合物用于琼脂糖凝胶电泳结果图；图16为对照品SYBRSafe细胞毒性安全性能测试图；图17为本专利技术实施例1制备的式Ⅲ化合物细胞毒性安全性能测试图。具体实施方式为对本专利技术的
技术实现思路
、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。实施例1双链DNA结合荧光染料的制备本实施例的双链DNA结合荧光染料的制备方法如下：1）将原料2-甲基苯并噻唑(0.30g，2.0mmol，1eq)缓慢滴加到1,2-二碘乙烷(2.85g，10.1mmol，5eq)的乙醇溶液中，温度控制在60℃。30min左右滴加完毕后，将温度调至回流温度，并持续90min。反应完成后，移除溶剂，并在丙酮中结晶得到目标产物中间体I：。2）分别将中间体I（1.0mmol，1eq）、甲胺（0.48mmol，0.48eq）的甲醇溶液和二异丙基乙胺（2.5eq）并液，加入10mL的正丁醇做溶剂，反应采用封管，加热温度为135℃，制备并液相分离得到中间体Ⅱ：所得中间体Ⅱ的核磁共振谱图如图1所示。3）由中间体Ⅱ（0.5mmol，1.0eq）、4-N,N'-二甲氨基苯甲醛（0.75mmol，1.5eq）和催化量的乙酸:哌啶（v/v）混合液（0.8mL）一次溶于25mL的乙醇中。混合溶液回流反应4h后，真空移除溶液，制备并液相分离、纯化得到最终产物（Ⅲ）：其中，催化剂体系乙酸:哌啶（v/v）=1:1～1:4。该最终产物（即式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料）的核磁共振谱图如图2所示。实施例2实时荧光定量PCR扩增针对目的基因GAPDH，以PromegaControlDNA为模板，以实施例1制备的式Ⅲ化合物为荧光染料，使用ABI7500荧光定量PCR仪，进行实时荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR扩增的引物序列分别如下：上游引物：CTGCCAGCCTAGCGTTGAC（SEQIDNO:1）下游引物：CCAATCCTCCCGGTGACAT（SEQIDNO:2）20μLPCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，2.5mMdNTP1.6μL，25mMMgCl21.6μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，ROXII0.2μL，5U/μLrTap酶（TAKARA）0.125μL，模板DNA（PromegaControlDNA）1.0μL(分别含80、40、20、10、5ngDNA)，式Ⅲ结构的荧光染料1.0μL（终浓度分别为0.375nM、0.75nM、1.5nM和3nM）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双链DNA结合荧光染料，其特征在于，该荧光染料的分子结构中包含有式ⅰ所示的结构或其立体异构体：/n

【技术特征摘要】
1.双链DNA结合荧光染料，其特征在于，该荧光染料的分子结构中包含有式ⅰ所示的结构或其立体异构体：



（ⅰ）。


2.根据权利要求1所述的双链DNA结合荧光染料，其特征在于，所述荧光染料的分子结构式为：



其中，X为卤素。


3.根据权利要求2所述的双链DNA结合荧光染料，其特征在于，所述X为Br或I。


4.根据权利要求1所述的双链DNA结合荧光染料，其特征在于，所述立体异构体具有式（ⅲ）或式（ⅳ）所示的结构：



（ⅲ）



（ⅳ）。


5.权利要求1-3任一项所述双链DNA结合荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）2-甲基苯并噻唑与1,2-二碘乙烷反应获得中间体I：



2）中间体I与甲胺反应获得中间体Ⅱ：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐祎春，崔雷，韩峻松，袁箐，周佳菁，苏军，周欣怡，
申请(专利权)人：上海生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31