一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白(rhLF)水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用，该水凝胶以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶，制得的水凝胶呈现的持续释放rhLF特性，能提高小鼠的免疫力且无毒，因此作为增强机体免疫力的药物。

Oral recombinant human lactoferrin silk protein hydrogel and its application in preparing drugs for enhancing immunity

【技术实现步骤摘要】
一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，还涉及水凝胶在制备增强免疫力的药物中的应用。
技术介绍
免疫系统是脊椎动物在体内平衡受到严重干扰时的一种高度复杂的防御机制，主要由病原体、损伤、外部污染物和感染引起。免疫反应由先天免疫系统和适应性免疫系统激活和介导。在抵抗疾病方面，免疫反应的调节起着重要的作用，早在一百多年前免疫系统控制肿瘤细胞的能力就被提出，并且在过去的十多年中得到证实，药物对免疫调节和免疫刺激的研究非常重要，且得到了广大研究者的重视。癌症是一种极其复杂的疾病，尽管世界各地的研究者对癌症的治疗研究乐此不疲，但仍阻止不了其发生，根据统计，2018年新增癌症病例1700万例，癌症相关死亡950万例，环磷酰胺是临床上重要的化疗药物之一，其治疗效果在一定程度上归因于其刺激抗肿瘤免疫反应的能力，但是在抑制肿瘤生长的同时，环磷酰胺可转化为4-羟基环磷酰胺，与DNA结合，诱导免疫细胞凋亡。已有研究表明，高剂量和长时间使用环磷酰胺可对人体健康和实验动物产生明显的毒副作用。为了降低环磷酰胺产生的毒副作用，更好地发挥环磷酰胺的抗肿瘤作用，研究人员进行了多方面的研究，例如利用环磷酰胺联合辅助药物降低环磷酰胺的使用剂量；在使用高剂量环磷酰胺的同时补充CD4阳性T细胞进行特异性肿瘤免疫，从而抑制肿瘤的生长；或者寻找药物如有天然植物提取物，增强机体自身免疫力，重塑由环磷酰胺引起的免疫器官萎缩，增强小鼠血清免疫蛋白产生。总的来说，免疫系统是人赖以生存的根本之一，癌症病人在治疗过程中化疗药物发挥极其重要的作用，然而化疗药物损害免疫系统的副作用不可忽视，缓解高剂量环磷酰胺带来的毒副作用一直是研究人员致力的研究热点。乳铁蛋白是一种多功能的天然免疫糖蛋白，研究者已经揭示了其在免疫、抗菌、抗肿瘤、抗氧化，刺激细胞增长等方面的生物学活性。乳铁蛋白在人初乳中含量高达7mg/mL，新生儿在取食乳汁的时候摄入的乳铁蛋白对于其宿主防御中起着关键的作用，主要通过调节新生儿抗感染的先天和适应性免疫反应，在乳铁蛋白作用于免疫细胞研究中发现，乳铁蛋白可经过受体被转运到细胞内，细胞信号通路例如PI3K/Akt和MAPK/ERK被激活，从而激活细胞周期进程，促进细胞增殖和下游细胞反应。乳铁蛋白受体在小肠部位高量表达，这预示着小肠是调节乳铁蛋白多功能的重要场所。因此，食用的乳铁蛋白在穿过消化系统过程中保持蛋白结构完整不被降解是乳铁蛋白受体发挥作用的必要条件。然而，目前几乎所有的蛋白质治疗都是通过静脉注射、皮下注射或肌肉注射进行的，不可否认注射是一种可靠的给药途径，但是这对于患者来说是痛苦的，尤其是在公共场合给药，给药的便捷性降低和给药技术难度等缺陷均这无疑降低患者给药的积极性。由于胃肠道消化的复杂性及消化过程中其他因子(例如pH，酶，离子强度)的存在，药物往往容易被降解，口服蛋白药物的疗效及发展因此受到限制。药物传递系统的研发使口服蛋白药物成为了可能。在过去数十年的研究中，研究人员开发多种传递系统包括水凝胶系统、纳米颗粒、脂质体和胶束等，旨在促进药物渗透，降低蛋白水解率，延长蛋白在肠胃停留时间，从而提高口服蛋白的生物利用率。然而，在这些传递系统中存在药物突发性释放，低载药量，加工复杂或者在加工过程中活性物质失活等缺陷限制了他们在临床应用的发展。因此，发展一种简易且高效的药物传递系统提高乳铁蛋白的治疗效率是有必要的。水凝胶是三维网状交联的水溶性聚合物，通常具有高含水量(可以高达99.9％)和良好的生物相容性。水凝胶在临床实践和实验医学中被广泛应用，如细胞治疗，伤口敷料，生物粘附，组织工程和再生医学等。水凝胶独特的理化性质引起了研究人员对于其用作药物载体的兴趣。丝胶是家蚕丝主要的成分之一，具有良好的亲水性、生物相容性和降解性，是一种非常有用的生物材料，例如丝胶增强细菌纤维素作为组织工程支架用于肠道修复，丝胶和聚乙烯醇组成的水凝胶承载纳米银可以有效抑制细菌和真菌的生长，软琼脂丝胶水凝胶能够促进慢性伤口的愈合，可注射丝胶水凝胶课作为体内缺血心肌修复的生物材料，丝胶/左旋糖酐制备的可注射水凝胶承载阿霉素可以显著抑制小鼠黑色素瘤的生长。有意思的是，丝胶的高分子特性(超过300KDa)可以使其在不添加交联剂的情况下自组装成水凝胶，研究表明以纯丝胶生物材料装载FGF1的水凝胶体外可以显著促进细胞的增殖。目前对于纯丝胶蛋白制备的生物材料主要用于组织工程修复，而以其制备的纯丝胶水凝胶口服传递药物的研究尚待研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的利用之前的研究中已经建立一种新的家蚕品系，重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系，利用该品系制备一种水凝胶，用高浓度的尿素提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶，同时重组人乳铁蛋白被装载到丝胶水凝胶。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的目的之一在于提供一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，具体方案如下：一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，所述水凝胶的制备方法如下：以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶。优选的，所述提取丝胶蛋白的具体步骤如下：将蚕茧粉碎成蚕茧粉，用浓度为8M尿素溶液提取，过滤去掉未溶解的丝素，离心收集上清，获得丝胶蛋白。优选的，所述尿素溶液中含有pH8.0、50mM的Tris-HCl。优选的，所述提取的条件是80℃水浴锅中提取1h。优选的，提取丝胶蛋白中蚕茧与尿素溶液的浴比为40mg/mL。优选的，所述水凝胶酰胺III分析特征峰出现在1413cm-1，160cm-1，和1640cm-1处，酰胺I分析吸收峰分别为1614cm-1，6,10cm-1，1663cm-1和1687cm-1。优选的，所述水凝胶的外部孔径大于内部孔径，外部孔径集中于5-9微米，内部横截面和纵截面的孔径集中于3-5微米。本专利技术的目的之二在于提供重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶的用途，具体方案如下：所述重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶在制备增强机体免疫力的口服药物中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种口服型重组人乳铁蛋白(rhLF)丝蛋白水凝胶，rhLF丝胶水凝胶呈现的持续释放rhLF特性，为提高rhLF生物利用度提供了依据。为了评价重组人乳铁蛋白丝胶水凝胶增强，免疫力的作用，通过建立了环磷酰胺诱导小鼠免疫力低下模型，每天口服给药，给药结束后检测与小鼠免疫力相关的指标，结果显示小鼠的免疫力得到提高，因此可以作为增强机体免疫力的药物。更进一步的急性毒理实验初步评判转基因丝胶水凝胶的毒性，结果显示rhLF水凝胶无毒。rhLF丝胶水凝胶的毒性和增强免疫力的生物学活性研究结果意味着其具有巨大的市场应用前景。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为水凝胶制备及其特性分析(A：丝胶溶液；B：水凝胶；C：水凝胶二级结构；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法如下：以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶。/n

【技术特征摘要】
1.一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法如下：以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶。


2.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述提取丝胶蛋白的具体步骤如下：将蚕茧粉碎成蚕茧粉，用浓度为8M尿素溶液提取，过滤去掉未溶解的丝素，离心收集上清，获得丝胶蛋白。


3.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述尿素溶液中含有pH8.0、50mM的Tris-HCl。


4.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述提取的条件是80℃水浴锅中提取1h。

【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，王峰，许胜，赵萍，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50