龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用制造技术

本发明专利技术公开了龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用，取24只小鼠随机分成APAP模型组、N‑乙酰‑L‑半胱氨酸阳性对照组（50 mg/kg）、LHRD低剂量组、LHRD高剂量组，另取6只小鼠设为正常对照组。固定时间给药6天后禁食22小时，腹腔注射250 mg/kg APAP，6 h后处死小鼠并取其血清和肝脏。采用试剂盒检测各组小鼠的血清谷丙转氨酶（ALT）活性及肝脏中谷胱甘肽（GSH）含量，苏木素‑伊红（H&E）染色观察肝脏组织形态学变化，Western Blot检测肝脏组织谷氨酸‑半胱氨酸连接酶催化亚基和核酸内切酶G的表达。荧光探针DCFH‑DA法检测组织细胞内的活性氧（ROS）表达。结论：LHRD可改善过量对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤，增强肝脏抗氧化应激能力。

Application of Longhu Rendan in prevention and treatment of drug-induced liver injury

【技术实现步骤摘要】
龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用
本专利技术涉及一种龙虎人丹新用途，具体地说，涉及一种龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用。
技术介绍
药物性肝损伤（drug-inducedliverinjury,DILI）是指由化学药物、生物制剂、抗生素、中药及中成药、膳食补充剂及其代谢产物等所诱发的肝损伤。对乙酰氨基酚（APAP）作为常用的OTC类解热镇痛药，它在推荐剂量下安全有效，然而过量可能导致肝毒性和急性肝衰竭，其肝毒性是美国和英国药物性肝衰竭最常见的原因。按照推荐剂量服用时，大多数APAP与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合后随尿液排出体外，约5%~9%的APAP被细胞色素P450系统（主要是CYP2E1）转化成有毒的活性代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，NAPQI再被谷胱甘肽(GSH)迅速转化为无毒代谢物。然而，当APAP过量时，会导致GSH耗竭，NAPQI的持续生成造成肝损伤。有研究结果表明，APAP诱导的肝损伤模型中，GSH耗尽的线粒体产生的活性氧（ROS）增加，导致线粒体通透性发生改变，从而抑制线粒体的生物功能，核酸内切酶G（EndoG）和凋亡诱导因子（Apoptosis-InducingFactor，AIF）移位至细胞核，导致细胞核DNA断裂，最终导致肝细胞坏死。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为APAP中毒唯一有效的解毒剂，它必须在APAP消耗后尽早使用才能获得最大药效，这对大多数APAP过量患者，尤其是那些无意过量服用APAP的患者来说，几乎不太可能实现。若治疗不及时导致病情发展至肝衰竭，肝衰竭唯一根治的手段是肝移植，但是由于时间紧急、供体稀缺、价格昂贵等多种因素，限制了其大范围应用。因此，需要寻找其他有效的防治药物。龙虎人丹，非处方中成药，主治开窍醒神，祛暑化浊，和中止呕，用于中暑头晕，恶心呕吐，腹泄及晕车、晕船。其主要成分有薄荷脑、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、儿茶、甘草、糯米粉、苯甲酸钠、红氧化铁、糊精、滑石粉、甲基硅油、石墨粉剂、乙醇。经申请人研究发现，龙虎人丹干预后肝细胞损伤情况得到较好改善，为此，申请人进一步实验研究，并申请专利保护。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，利用龙虎人丹来防治长期或过量服用对乙酰氨基酚（APAP）所致的急性肝损伤。本专利技术的方案是：龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用。所述药物性肝损伤是由长期或过量服用对乙酰胺基酚所致的急性肝损伤。用于包括人在内的哺乳动物。附图说明图1为各实验组血清ALT活性比较图，其中与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：龙虎人丹低剂量##P<0.01,龙虎人丹高剂量#P<0.05。图2为各实验组小鼠肝脏组织H&E染色结果比较图，其中A为空白组；B为模型组；C为NAC组；D为龙虎人丹低剂量组；E为龙虎人丹高剂量组。图3为各实验组小鼠肝脏GSH水平比较图，与空白组比较：**P<0.05；与模型组比较：龙虎人丹低剂量##P<0.01,龙虎人丹高剂量#P<0.05。图4为各实验组小鼠肝脏ROS表达情况比较图，A为空白组；B为模型组；C为NAC组；D为龙虎人丹低剂量组；E为龙虎人丹高剂量组。图5为各实验组小鼠肝脏GCLC和EndoG蛋白表达比较图，与空白组比较：****P<0.01；与模型组比较：龙虎人丹低剂量####P<0.01,龙虎人丹高剂量####P<0.01（EndoG）；与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：低剂量####P<0.01,高剂量####P<0.01（GCLC）。具体实施方式具体实验过程：1.动物健康SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，6-8周龄，由广东省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034，实验单位使用许可证编号：SYXK（粤）2017-0125。6只/笼，群养，自由饮水进食。2.药物龙虎人丹（上海中华药业有限公司生产），对乙酰氨基苯酚、NAC（上海麦克林生化科技有限公司生产），羧甲基纤维素钠（CMC-Na，生工生物工程（上海）股份有限公司），PBS粉末（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。3.主要试剂及仪器Anti-GCLC（PROTEINTECHGROUP），Anti-EndoG（AffinityBiosciences），Anti-β-actin（北京全式金生物技术有限公司），ALT检测试剂盒、GSH检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司），苏木素、伊红（上海宏兹实业有限公司）。电子天平（德国MettlerToledo仪器有限公司），高速冷冻离心机（美国赛默飞公司），微型蛋白电泳转印系统（美国伯乐公司），化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司），脱水机、包埋机（湖北亚光医用电子有限公司），切片机（德国徕卡公司），显微镜（日本奥林巴斯公司），酶标仪（美国赛默飞公司）。4.造模及干预方法将30只雄性C57BL/6小鼠随机均分成5组：正常对照组（CMC-Na）、APAP模型组（250mg/kg）、NAC阳性对照组（50mg/kg）、龙虎人丹低剂量组（80mg/kg）、龙虎人丹高剂量组（160mg/kg）。采取预防性给药，即连续灌胃给药6天后造模。除正常对照组，其余组别小鼠参照参考文献（FurutaK,YoshidaY,OguraS,etal.Gab1adaptorproteinactsasagatekeepertobalancehepatocytedeathandproliferationduringacetaminophen-inducedliverinjuryinmice[J].Hepatology,2016,63(4):1340-1355.）建立过量对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤模型：晚上19:00开始禁食，22h后，于次日下午17:00点造模，即腹腔注射250mg/kgAPAP，正常对照组则腹腔注射PBS，给药体积均为20μl/g。5.检测指标及方法5.1血清ALT测定血清ALT测定采用微板法，按照试剂盒说明书操作：处理后的血清样本置于室温环境稳定后，用酶标仪于510nm波长处测定各个孔的OD值，根据标准曲线计算得出血清ALT值。5.2肝脏组织H&E染色将小鼠肝脏组织用10%的中性缓冲甲醛液固定，脱水，石蜡包埋、切片、脱蜡，使用苏木素和伊红对组织进行染色，脱水，中性树胶封片，镜下观察其肝脏组织形态学变化。5.3肝脏GSH水平检测准确称取组织重量，按重量（g）:体积（ml）=1:9的比例，加入9倍的生理盐水制成组织匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液按照说明书检测GSH含量。5.4WesternBlot检测肝脏组织GCLC和EndoG蛋白表达各组小鼠肝脏组织经匀浆、离心后收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，按照说明书配制分离胶及浓缩胶，进行蛋白电泳后采用半干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物性肝损伤是由长期或...

【专利技术属性】
技术研发人员：金家骅，丁礼琴，曹无介，朱晓萍，展学强，陈晓，兰天，
申请(专利权)人：上海中华药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31