一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和PSR方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和PSR方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术能够通过钙黄绿素显色法、pH指示剂显色法、浊度法或荧光法对肺炎克雷伯杆菌进行检测。本发明专利技术的检测方法操作简便，反应时间短，灵敏度高，是普通PCR反应的10倍，特异性强，仅能检测出肺炎克雷伯杆菌。

A primer combination, kit and PSR method for detection of Klebsiella pneumoniae

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和PSR方法
本专利技术涉及生物检测
，更具体的说是涉及一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和PSR方法。
技术介绍
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)是一种主要的导致体内感染的革兰氏阴性菌，它会引起肺炎、泌尿道和伤口感染等疾病，在婴儿、糖尿病患者、肿瘤患者、长期使用抗生素的病人和老年人中发病率高。此外，近些年来越来越普遍的耐药肺炎克雷伯杆菌已成为临床上一个重要难题，因此需要建立一种快速和敏感的检测方法。肺炎克雷伯杆菌的传统检测方法包括基于表型和生理生化指标的微生物镜检法、生化鉴定法和最新的全自动细菌鉴定仪，但这些方法耗时长、灵敏度低，经常需要数天的细菌培养时间。近些年来，一系列新专利技术的分子生物学技术被用来检测肺炎克雷伯杆菌，如用基于16S-23S内部转录间隔区的PCR在婴儿奶粉中检测肺炎克雷伯杆菌，也有三重PCR和实时荧光定量PCR的肺炎克雷伯杆菌检测技术，然而这些技术都相对比较复杂，需要专业的、昂贵的仪器，此外PCR中使用的Taq酶容易被原始样本中的抑制物抑制而失活。因此，提供一种利用聚合酶螺旋反应(PSR)检测肺炎克雷伯杆菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和PSR方法，操作简单，灵敏度高，特异性强。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：荚膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯杆菌的重要致病因子，而rcsA基因调控荚膜多糖的合成，并且是肺炎克雷伯杆菌的特有基因，因此本专利技术选它作为肺炎克雷伯杆菌检测的靶基因，根据rcsA基因序列设计一套PSR引物，并评价其最佳温度、特异性和敏感性，最终用完善后的方法来应用于样本检测。一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合，具体引物序列如下：rcsA-Ft1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGTAAAAAACAGGAAATCGTTGAGG-3’；SEQIDNO.1；rcsA-Bt1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGGCGAATAATGCCATTACTTTC-3’；SEQIDNO.2；rcsA-IF：5’-ATCCGCAGCACTGTTGA-3’；SEQIDNO.9；rcsA-IB：5’-GAAGACTGTTTCGTGCATGATGA-3’；SEQIDNO.10。进一步，含有上述引物组合的试剂盒。一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的PSR方法，包括如下步骤：用上述的引物组合对待测样本进行PSR反应，检测PSR反应产物，确定待测样本是否为肺炎克雷伯杆菌。进一步，所述PSR反应体系如下：12.5μl的2×RM，2.0μlDNA模板和1.0μlBstDNA聚合酶，引物的rcsA-Ft1、rcsA-Bt1各1.6μM，rcsA-IF、rcsA-IB各0.8μM，并用水补齐25μl。进一步，所述PSR反应条件为65℃，60min。进一步，所述确定待测样本是否为肺炎克雷伯杆菌的方法为a、b、c或d：a、钙黄绿素显色法在PSR反应体系中加入1.0μl钙黄绿素指示剂；恒温扩增反应结束后，若待检样品反应管液体呈黄绿色，表示检出肺炎克雷伯杆菌，该样品检测结果为阳性；若待检样品反应管液体呈橙红色，表示未检出肺炎克雷伯杆菌，检测结果为阴性；b、pH指示剂显色法在PSR反应体系中加入1.0μlpH指示剂(0.08mM甲酚红和0.02mM苯酚红)；恒温扩增反应结束后，若待检样品反应管液体呈黄色，表示待测样本中存在肺炎克雷伯杆菌；若待检样品反应管液体呈红色，表示待测样本中不存在肺炎克雷伯杆菌；如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色无变化，则本次检测结果无效，应重新检测；c、浊度法浊度仪检测所述待测样本PSR反应产物浊度变化曲线，若所述待测样本PSR反应产物浊度变化曲线呈S型反应曲线，则待测样本中存在肺炎克雷伯杆菌，若所述待测样本PSR反应产物浊度变化曲线未形成明显S型反应曲线，则所述待测样本中不存在肺炎克雷伯杆菌；d、荧光法阳性反应的表现为：在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现；结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，待检样本在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(Tm变化范围在1-3℃之内)，此时待检样本判断为阳性，否则为阴性；如果阳性待检样本发生了阴性反应，或者阴性待检样本发生了阳性反应，应重新检测。钙黄绿素显色法：钙黄绿素是一种金属螯合剂；在反应前，钙黄绿素与Mn2+络合，Mn2+猝灭了钙黄绿素的荧光，反应液呈橙红色，此时溶液中的镁呈二价离子状态，不会置换Mn2+；而当发生PSR反应后，会生成大量的焦磷酸酶沉淀，此时Mn2+就会与Mg2P2O7发生置换反应生成Mn2P2O7和Mg2+，而Mg2+不具有猝灭钙黄绿素荧光的作用，荧光得以释放使溶液由橙色变成绿色。当反应为阴性时，溶液保持橙红色不变；反应后呈黄绿色判为阳性，橙红色则为阴性。pH指示剂显色法检测：恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在肺炎克雷伯杆菌基因(阳性)，检测管颜色无变化(红色)表示待测样本中不存在肺炎克雷伯杆菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色无变化(红色)，则本次检测结果无效，应重新检测。pH指示剂显色法检测原理为：当DNA聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的DNA双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着PSR反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的pH值降低。将pH指示剂溶液加于25μl上述PSR反应体系中，阳性反应变为黄色，阴性对照溶液维持红色不变。浊度法检测原理为：在PSR反应过程中形成Mg2P2O7即焦磷酸镁，为白色沉淀，发生反应式如下:(DNA)n-1+dNTP→(DNA)n+P2O74-P2O74-+2Mg2+-→Mg2P2O7↓。据此反应原理，实时浊度仪LA-320c每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性；形成反应曲线-S型折线，则为阳性；未形成明显反应曲线-无S型折线，则为阴性。荧光实时检测方法为：设定吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，此波长和SYBRGreenI相同，为绿色荧光；将反应体系置于荧光定量仪中，开始反应。阳性反应的表现为：在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，样本在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(Tm变化范围在1-3℃之内)，此时样本可以判断为阳性，否则为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合，其特征在于，具体引物序列如下：/nrcsA-Ft1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGTAAAAAACAGGAAAT CGTTGAGG-3’；SEQ ID NO.1；/nrcsA-Bt1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGGCGAATAATGCCATTAC TTTC-3’；SEQ ID NO.2；/nrcsA-IF：5’-ATCCGCAGCACTGTTGA-3’；SEQ ID NO.9；/nrcsA-IB：5’-GAAGACTGTTTCGTGCATGATGA-3’；SEQ ID NO.10。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合，其特征在于，具体引物序列如下：
rcsA-Ft1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGTAAAAAACAGGAAATCGTTGAGG-3’；SEQIDNO.1；
rcsA-Bt1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGGCGAATAATGCCATTACTTTC-3’；SEQIDNO.2；
rcsA-IF：5’-ATCCGCAGCACTGTTGA-3’；SEQIDNO.9；
rcsA-IB：5’-GAAGACTGTTTCGTGCATGATGA-3’；SEQIDNO.10。


2.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒。


3.一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的PSR方法，其特征在于，包括如下步骤：用权利要求1所述的引物组合对待测样本进行PSR反应，检测PSR反应产物，确定待测样本是否为肺炎克雷伯杆菌。


4.根据权利要求3所述的一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的PSR方法，其特征在于，所述PSR反应体系如下：12.5μl的2×RM，2.0μlDNA模板和1.0μlBstDNA聚合酶，引物的rcsA-Ft1、rcsA-Bt1各1.6μM，rcsA-IF、rcsA-IB各0.8μM，并用水补齐25μl。


5.根据权利要求3所述的一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的PSR方法，其特征在于，所述PSR反应条件为65℃，60min。


6.根据权利要求3所述的一种用于检测肺...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，刘威，慈颖，张乔，张晓龙，杨燕，孙筱霞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11