以失活的筛选剂抗性基因为报告体系的A·G碱基替换的细胞富集技术及其应用制造技术

本发明专利技术公开了以失活的筛选剂抗性基因为报告体系的A·G碱基替换的细胞富集技术及其应用。所述细胞富集技术载体包括如下试剂：靶向目标基因靶点序列的sgRNA、靶向功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA、A·G碱基替换系统和功能丧失的筛选剂抗性基因；A·G碱基替换系统在靶向功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA的向导下，可通过对功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列进行A·G碱基替换使功能丧失的筛选剂抗性基因功能恢复。本发明专利技术实现了细胞水平上A·G碱基替换细胞富集，大大提高A·G碱基替换效率。

Cell enrichment technology and application of a \u00b7 g base substitution with inactivated screening agent resistance gene as report system

【技术实现步骤摘要】
以失活的筛选剂抗性基因为报告体系的A·G碱基替换的细胞富集技术及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及以失活的筛选剂抗性基因为报告体系的A·G碱基替换的细胞富集技术及其应用。
技术介绍
CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guideRNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNAbreak，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directedrepair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertionsordeletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。2017年，DavidLiu实验室报道了一种新型的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成套试剂，其包括sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料、A·G碱基替换系统和功能丧失的筛选剂抗性基因或与所述功能丧失的筛选剂抗性基因相关的生物材料；/n所述sgRNA由靶向目标基因靶点序列的sgRNA和靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA组成；/n所述sgRNA结构如下：所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架；/n所述A·G碱基替换系统包括Cas9核酸酶或与所述Cas9核酸酶相关的生物材料和腺嘌呤脱氨酶或与所述腺嘌呤脱氨酶相关的生物材料；/n所述A·G碱基替换系统在靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA的向导下，可通过对所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序...

【技术特征摘要】
1.成套试剂，其包括sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料、A·G碱基替换系统和功能丧失的筛选剂抗性基因或与所述功能丧失的筛选剂抗性基因相关的生物材料；
所述sgRNA由靶向目标基因靶点序列的sgRNA和靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA组成；
所述sgRNA结构如下：所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架；
所述A·G碱基替换系统包括Cas9核酸酶或与所述Cas9核酸酶相关的生物材料和腺嘌呤脱氨酶或与所述腺嘌呤脱氨酶相关的生物材料；
所述A·G碱基替换系统在靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA的向导下，可通过对所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列进行A·G碱基替换使所述功能丧失的筛选剂抗性基因功能恢复；
所述sgRNA骨架为S1)或S2)或S3)：
S1)将序列1第617-692位中的T替换为U得到的RNA分子；
S2)将S1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
S3)与S1)或S2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。


2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述功能丧失的筛选剂抗性基因为将筛选剂抗性基因的起始密码子删除，且在筛选剂抗性基因5’端添加代理靶点靶序列后得到的序列；所述A·G碱基替换系统在靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA的向导下，可通过对所述代理靶点靶序列进行A·G碱基替换使所述功能丧失的筛选剂抗性基因功能恢复。


3.根据权利要求2所述的成套试剂，其特征在于：所述代理靶点靶序列为序列5。


4.根据权利要求1-3任一所述的成套试剂，其特征在于：所述筛选剂抗性基因为潮霉素抗性基因。


5.根据权利要求1-4任一所述的成套试剂，其特征在于：所述Cas9核酸酶为SpCas9n蛋白质；
和/或，所述腺嘌呤脱氨酶为ecTadA蛋白质；
和/或，所述SpCas9n蛋白质为A1)或A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述SpCas9n相关的生物材料为B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述SpCas9n的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
所述ecTadA蛋白质为E1)或E2)或E3)：
E1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
E2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
与所述ecTadA蛋白质相关的生物材料为F1)至F5)中的任一种：
F1)编码所述ecTadA蛋白质的核酸分子；
F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；
F5)含有F1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因细胞系；
与所述功能丧失的筛选剂抗性基因相关的生物材料为K1)至K4)中的任一种：
K1)含有所述功能丧失的筛选剂抗性基因的表达盒；
K2)含有所述功能丧失的筛选剂抗性基因的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永星，杨进孝，康桂婷，王飞鹏，宋金岭，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11