本发明专利技术涉及一种RGD环肽R8肽修饰的麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法。该法冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF‑LIP，后采用后插入法制备。本发明专利技术成功构建了RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP主动载药脂质体递药系统；用ERG/GEF‑LIP进行冻干工艺和处方的考察，筛选出最佳处方工艺后将其应用到RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP中进行验证。RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP冻干粉的体外试验结果证实其具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，荧光摄取强度以及良好的细胞凋亡率。
Preparation, liposome and application of lyophilized powder of ergosterol combined with gefitinib compound liposome
【技术实现步骤摘要】
麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法、脂质体及用途
本专利技术涉及一种脂质体的制备方法，尤其涉及一种麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法、脂质体及用途。
技术介绍
由于癌症发病率和死亡率的持续增高，目前仍然是世界上最关注的难题之一。据统计，2015年中国大约新增了约430万例癌症病例，以及有约281万例癌症患者死亡，其中肺癌占据首位。国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer）编制的《2018年全球癌症发病率和死亡率估计》提供了一份全球癌症负担状况报告，预计2018年将有1810万新癌症病例和960万癌症死亡病例。其中肺癌是最常见的癌症（占总病例的11.6%），也是癌症死亡的主要原因（占总癌症死亡人数的18.4%）。临床上发现，肺腺癌已经逐渐替代肺鱗癌成为肺癌发病率最高的病理类型，约占NSCLC的一半，而NSCLC约占全部肺癌的85％。目前，临床一线化疗用药（铂类，阿霉素，紫杉醇等）在化疗过程中，均会出现多药耐药现象，最终导致疾病进一步进展。GEF是最早用于治疗NSCLC的分子靶向药物，目前常用于二线治疗药物应用于临床。GEF是一种表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，针对EGFR靶点的NSCLC具有较好的临床治疗效果。其作用机制主要通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争和EGFR的结合，通过AKT等途径阻断EGFR信号传导通路，抑制自身磷酸化以及活化，阻断表达EGFR的肿瘤细胞生长，阻断PI3K-AKT等下游信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤作用。对于发生EGFR突变的患者，GEF副作用的发生程度相较于化疗明显减轻。同时研究表明在女性患者、亚裔患者以及不吸烟患者中更多的观察到EGFR基因的突变。报道显示，东方国家的肺癌患者在临床上GEF的疗效往往都要好于西方国家。可见，GEF的深入研究对亚洲NSCLC患者有重要意义。针对肺癌，寻找一种能够与GEF产生协同作用的药物，拓展GEF的应用范围，改善靶向药物在肺癌治疗方面的临床应用，具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术要解决上述问题，在探讨了ERG与GEF联用具有协同抗肺癌的作用的基础上；针对ERG与GEF联用的药物制剂进行了脂质体的药物制剂开发。并对该药物制剂的制备方法以及药物制剂的质量、药效（动物实验）等方面进行了多方面的研究。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法：冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF-LIP，后采用后插入法制备。作为上述技术方案的优选，冷冻干燥法的具体为快冻法，具体为先使设备中的冷阱部分的温度预先降低到最低温度，再将样品置于冷阱中。作为上述技术方案的优选，冷冻干燥法的预冻时间为4h。作为上述技术方案的优选，冷冻干燥法的冷冻干燥时间为48h。作为上述技术方案的优选，冻干保护剂为蔗糖和甘露醇的组合，并且糖脂比为10:1，蔗糖和甘露醇的质量比为1:1。作为上述技术方案的优选，所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备方法具体为：按照SPC、Chole、RGD肽摩尔比5:1:0.07称取，制备R8-ERG/GEF-LIP；按照SPC、Chole、RGD肽、RGD肽摩尔比5:1:0.07:0.07称取，制备得到RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液。作为上述技术方案的优选，采用快冻法，在设备冷阱处放置4h后，转移到上层进行冻干干燥，冻干程序：-20~-10℃，15h；-10~0℃，15h；0~10℃，15h；10~20℃，15h；20~30℃，12h。本专利技术的另一个目的是提供由上述方法制备得到的脂质体冻干粉。本专利技术的在一个目的是提供脂质体冻干粉在制备抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的靶向药物中的应用。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术成功构建了RGD/R8-ERG/GEF-LIP主动载药脂质体递药系统；用ERG/GEF-LIP进行冻干工艺和处方的考察，筛选出最佳处方工艺后将其应用到RGD/R8-ERG/GEF-LIP中进行验证。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的体外试验结果证实其具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，荧光摄取强度以及良好的细胞凋亡率。2、本专利技术进行了相关体内研究，其中初步药效学试验说明了RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉对裸鼠本身没有大的毒副作用，不会导致裸鼠在给药期间发生精神不良，体重降低等不良反应，并且RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉和RGD/R8-ERG/GEF-LIP相比，体内抑瘤作用相差不大。这表明，将RGD/R8-ERG/GEF-LIP制备成冻干粉形式，并不会影响脂质体对于裸鼠PC-9/GR肺癌移植瘤的抑制作用。靶向性试验也证实了所制备的载药脂质体具有一定的靶向性。3、本专利技术建立在GEF联合ERG体外诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用机理基础上，构建RGD/R8-ERG/GEF-LIP主动载药靶向脂质体递药系统，并将其制备成冻干粉形式，进行体内外抗肺癌作用初步评价，并建立裸鼠肺癌移植瘤模型进行初步药效学研究和体内靶向性研究。ERG/GEF-LIP最佳制备工艺及其质量评价表明：ERG/GEF-LIP通过硫酸铵梯度法载药GEF。脂质体形态较圆整，具有双层结构，粒径分布均匀。pH6.4的释放介质下，ERG/GEF-LIP24h的累积释放率超过80%。GEF的平均包封率为96.49±1.00%，载药量为5.73±0.62%。ERG的平均包封率为95.33±0.21%，载药量为3.94±0.10%。体外实验表明，PC-9/GR细胞耐药指数为13.90，细胞高度耐药。ERG/GEF-LIP作用于PC-9/GR细胞的增殖抑制作用和荧光摄取强度最强。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的制备及其质量评价表明：通过后插入法制备RGD/R8-ERG/GEF-LIP，并采用快冻法，预冻4h，冷冻干燥48h制备RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉，每支脂质体冻干粉（5mL）中含有245mg蔗糖和245mg甘露醇（糖脂比为10:1，蔗糖与甘露醇质量比为1:1）。脂质体形态较圆整，具有双层结构，粒径分布均匀。pH6.4的释放介质下，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉24h的累积释放率超过80%，具有良好的血清稳定性。GEF的平均包封率为80.50±0.98%，载药量为4.67±0.17%。ERG的平均包封率为94.29±1.04%，载药量为3.59±0.41%。体外实验表明，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉作用于PC-9/GR细胞的增殖抑制作用、荧光摄取强度以及细胞凋亡率均较高，和冻干前相差无异。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉在裸鼠体内抑瘤作用及本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法：冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF-LIP，后采用后插入法制备。/n
【技术特征摘要】
1.麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法：冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF-LIP，后采用后插入法制备。
2.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：冷冻干燥法的具体为快冻法，具体为先使设备中的冷阱部分的温度预先降低到最低温度，再将样品置于冷阱中。
3.根据权利要求2所述的麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：冷冻干燥法的预冻时间为4h。
4.根据权利要求2所述的麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：冷冻干燥法的冷冻干燥时间为48h。
5.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：冻干保护剂为蔗糖和甘露醇的组合，并且糖脂比...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄绳武，黄挺，吴梅佳，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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