抗菌肽在抗分枝杆菌感染药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及药学领域，具体涉及抗菌肽在抗分枝杆菌感染药物中的应用。本发明专利技术从抗菌肽入手，研发了具有特殊结构和不常见作用模式的针对分枝杆菌的系列抗菌肽，该抗菌肽通过膜破坏机制杀死细菌，细菌不会产生耐药性。作为治疗结核病主要潜在药剂的抗菌肽填补了国内长期以来没有抗结核新药的空白。因此本发明专利技术提供的抗菌肽能够用来制备针对分枝杆菌的有效药物，有望成为抗分枝杆菌感染的潜在药物，是治疗结核病的主要潜在药剂。

Application of antimicrobial peptides in anti Mycobacterium infection drugs

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽在抗分枝杆菌感染药物中的应用
本专利技术涉及药学领域，具体涉及一种抗菌肽在抗分枝杆菌感染药物中的应用。
技术介绍
分枝杆菌属于含分枝菌酸类的放线菌，主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fastbacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。其种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是引起结核(TB)的致病性细菌，属于分枝杆菌的一种，主要通过呼吸道传播，能够引起咳嗽、胸痛、咯血，呼吸困难等症状。健康人感染结核菌并不一定发病，只有在机体免疫力下降时才发病。世界卫生组织(WHO)统计表明，全世界每年发生结核病800～1000万，每年约有300万人死于结核病，是造成死亡人数最多的单一传染病。尽管四十年前引入了价格合理且有效的四种药物(异烟肼，利福平，吡嗪酰胺和乙胺丁醇)，但目前结核病仍居全球死亡率和发病率高位。目前结核病的现状与主要面临的问题：(1)药物敏感性疾病治疗方案的长期性，结核病治疗的第一阶段，一线抗结核药物异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇需联合使用两个月，第二阶段需联合服用异烟肼和利福平四个月；(2)耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)日益增加；(3)HIV-TB合并感染的迅速增加也是一种危险的情况；(4)结核病潜伏感染可长达两年。1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题。结核分枝杆菌于1882年由德国微生物学家RobertKoch发现。在显微镜下，结核菌为细长稍弯曲或直的杆菌。结核分枝杆菌是专性需氧菌，生长很缓慢，在固体培养基上，结核菌增代时间为18-20h，培养时间需8天以上至8周，在大部分培养基上菌落呈粗糙型。Mtb是一种细胞内细菌，在巨噬细胞内持续存在并复制。Mtb具有独特且复杂的细胞壁结构，分枝杆菌的细胞壁约有60％的脂质成分，而革兰氏阴性细菌仅有约20％的脂质，这些脂质赋予了分枝杆菌表面高度的疏水性。耻垢分枝杆菌(MycobacteriumSmegmatis)是杆菌中的耐酸菌种，长3.0～5.0μm，呈杆状，可用金胺O-罗丹明荧光法染色。Lustgarten于1884年11月首次报道。因为它是“快速生长者”和非致病性的，所以被研究者用来作为一种简单的模型来研究其他类的分枝杆菌。该菌共有2000多个与结核分枝杆菌同源的基因，并具有与结核分枝杆菌和其他分枝杆菌菌种相同的特有的细胞壁结构。它也能够和结核分枝杆菌一样有氧氧化一氧化碳。因此，研究者常用它来对治疗结核病的药物进行表型筛选。但迄今为止，本专利技术所涉及抗菌肽在抗分枝杆菌感染中的应用未见报道。
技术实现思路
为弥补现有技术空白，本专利技术提供了一类针对结核分枝杆菌的模式菌－耻垢分枝杆菌的抗菌肽(AMP)及该抗菌肽的应用。该抗菌肽是由专利技术人所在实验室的设计并合成得到的。本专利技术的专利技术构思是：专利技术人从中国林蛙分泌物中分离纯化得到的含有18个氨基酸的短肽chensinin-1，通过对chensinin-1进行一系列改造，以疏水性较强的色氨酸替换了疏水性较弱的甘氨酸并调整氨基酸序列增强了其两亲性得到了它的改造肽。专利技术人在研究改造肽序列构效关系研究的基础上，发现截取片段序列VWRHWRRFWHR具有与母肽相似的抗菌活性，并通过利用精氨酸取代序列中的组氨酸得到最终序列：VWRRWRRFWRR。但专利技术人发现其稳定性较差，因此在前期工作基础上根据蛋白酶水解位点的差异，通过在序列中引入D型氨基酸以改变其氨基酸构型合成了抗菌肽vwrrwrrfwrr和VWrrWrrFWrr，筛选结果发现其改造系列抗菌肽对耻垢分枝杆菌具有显著的抑制活性和稳定性。为了进一步增加该系列抗菌肽的抗分枝杆菌活性，专利技术人对抗菌活性较好且水解稳定的D型vwrrwrrfwrr进行改造，在其N端分别连接乙酸、丁酸、正辛酸、月桂酸和棕榈酸，以期通过疏水性的调整增强抗菌活性，结果发现在N端连接乙酸和丁酸后，C2-D-P和C4-D-P的抗菌活性得到了增强。本专利技术请求保护如表1所示的系列抗菌肽：表1抗菌肽的理化性质表1中C2代表乙酸，C4代表丁酸，C8代表正辛酸，C12代表月桂酸，C16代表棕榈酸。本专利技术同时请求保护上述系列抗菌肽的应用，即在抗分枝杆菌感染药物制备上的应用，特别是耻垢分枝杆菌及减毒型分枝杆菌M.bovisBCG感染药物制备上的应用。本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术从抗菌肽入手，研发了具有特殊结构和不常见作用模式的针对分枝杆菌的系列抗菌肽，抗菌肽是包含一部分先天免疫系统的小的阳离子两亲性肽，本专利技术所设计的抗菌肽具有破坏正常分枝杆菌细胞壁功能的能力，并且可以与细胞内靶标包含核酸、酶和细胞器等进行相互作用，对于与结核分枝杆菌同源性比较高的耻垢分枝杆菌以及减毒型分枝杆菌M.bovisBCG均具有很强的抑制作用。本专利技术在对于分枝杆菌的抗菌活性研究中发现，本专利技术提供的系列抗菌肽对分枝杆菌有较好的抗菌活性，可以在短时间内杀死分枝杆菌，且无需联合用药，其中C2-D-P、C4-D-P、D-P和D/L-P型抗菌肽的作用活性更高，其次是L-P。该抗菌肽可以在16倍MIC、9小时内将一定数量的耻垢分枝杆菌全部杀死；该抗菌肽通过膜破坏机制杀死细菌，细菌不会产生耐药性。作为治疗结核病主要潜在药剂的抗菌肽填补了国内长期以来没有抗结核新药的空白。因此，本专利技术提供的抗菌肽能够用来制备针对分枝杆菌的有效药物，有望成为抗分枝杆菌感染的潜在药物，是治疗结核病的主要潜在药剂。附图说明图1是抗菌肽溶血活性测定的示意图；图2是抗菌肽对耻垢分枝杆菌的杀菌动力学实验示意图；图3是抗菌肽对耻垢分枝杆菌外膜通透性影响的示意图；图4是抗菌肽对耻垢分枝杆菌内膜通透性影响的示意图；图5是抗菌肽对耻垢分枝杆菌的扫描电镜结果的示意图。具体实施方式下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。本专利技术所涉及的抗菌肽，其序列结构均为专利技术人设计。实施例1本专利技术系列抗菌肽，P(peptide的缩写)是本实验室通过改造中国林蛙皮肤抗菌肽chensinin-1得到的。该抗菌肽是具有18个氨基酸的短肽，其序列为：SAVGRHGRRFGLRKHRKH。chensinin-1b是通过对chensinin-1进行改造，以疏水性较强的色氨酸替换了疏水性较弱的甘氨酸并调整氨基酸序列增强了其两亲性得到的改造肽。其序列为：SKVWRHWRRFWHRAHRKL。L-P型是截取了chensinin-1b的第3-13位氨基酸，其中第4位和第10位的精氨酸(R)代替组氨酸(H)设计了L-P型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗菌肽，其特征在于，具有如下所示氨基酸序列：/n

【技术特征摘要】
1.抗菌肽，其特征在于，具有如下所示氨基酸序列：



其中，C2为乙酸，C4为丁酸，C8为正辛酸，C12为月桂酸，C16为棕榈酸。


2.权利要求1所述的抗菌肽在抗分枝杆菌感染药物制备上的应用。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：董维兵，尚德静，骆雪月，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21