纯化透明质酸的方法技术

描述了一种纯化HA的方法，以及包含由此纯化的HA的药物、化妆品和营养组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化透明质酸的方法专利
透明质酸(HA)是一种线性、阴离子型且不含硫酸基团的高分子量多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的交替残基组成。它天然存在于细胞周围的凝胶中，存在于脊椎动物生物体的结缔组织的基本物质中(其代表主要成分之一)，存在于关节的滑液中，存在于玻璃体液中和存在于脐带中。因此，HA在生物有机体中起着重要作用，首先是对许多组织(如皮肤、肌腱、肌肉和软骨)的细胞提供机械支持。还已知HA通过其膜受体，特别是CD44、CD54和CD168，调节与细胞的生理和生物学有关的许多不同过程，例如增殖、迁移、细胞分化和血管生成，以及它还执行其他功能，例如组织水合作用和关节润滑。它具有绝对的生物相容性，并且由于其许多特殊功能，多年来已广泛用于从组织修复到粘液补充疗法，从皮肤美容药物到眼内手术，从组织工程到细胞治疗等各个领域。HA的化学、物理和生物学特性与它的分子量(MW–指通过“固有粘度”方法计算的重均分子量)密切相关，这是非常可变的：通常可以说，HA的重均分子量大约从20,000到13x106Da变化，并且所述大约是必须的，因为它会根据来源以及用于分离它的生产和纯化方法而发生根本变化。基本上有两种获取HA的基本方法：从动物来源生产：从历史上讲，HA是从动物组织(例如脐带、玻璃体液或牛滑液)中提取的，尤其是公鸡冠。动物来源的生产有很多限制，价格昂贵，例如，由于需要大量步骤来去除各种杂质(从消化起始组织后的大量有机残留物开始)，因此需要采取一些步骤来确保灭活和去除可能存在于起始原料中的任何污染剂(例如病毒)，它需要大量的原料，并且收率不高；微生物的发酵：某些微生物，特别是链球菌(Streptococcus)或巴斯德氏菌(Pasteurella)属的微生物，如果经过适当的刺激和/或修饰，能够产生HA，HA分泌在培养液中，通过对本领域技术人员已知的不同方法从中分离。同样在这种情况下，需要许多步骤来去除存在的“杂质”，例如，所用微生物的细胞壁残留物、金属离子、核酸和任何其他不希望的蛋白质物质。尽管有这些限制，但这仍然是生产HA的最成熟和使用最广泛的方法。通过生物技术生产HA的新方法也在研究中，通过在合适的宿主细胞，例如芽孢杆菌属(Megaterium和Subtilis)和大肠杆菌中转染表达HA合酶的基因。然而，对于这些生产方法，去除所有潜在有害残留物所需的所有程序也是必需的。无论如何，无论采用哪种方法，获得HA的关键步骤显然是多糖的提取和纯化阶段。有许多已知的方法，所有这些方法都非常明确，并且相对于获取HA的起始来源而言显然是经过调制的。首先，必须去除来源的残留物，因此，为了从动物组织中提取蛋白质，存在蛋白质的消化阶段，然后进行过滤，离心和洗涤。对于发酵，通常进行离心和逐步洗涤。在任何情况下，都会获得液体级分，然后从中分离出多糖。在这方面，最广为人知且肯定是最常用的方法，尤其是对于动物来源的HA，是溶剂沉淀法：对于较大的生产线，在上述液体级分上使用增加浓度的有机溶剂(乙醇、丙酮)，引起透明质酸沉淀，然后将其通过随后的溶解和沉淀进行纯化。另一种系统涉及使用季盐，例如鲸蜡基吡啶鎓或鲸蜡基三甲基铵，其具有使多糖络合并诱导其沉淀的功能。同样，随后的溶解和沉淀对于获得最终产物是必需的。技术的发展还结合了上述关键步骤，以使该方法在收率方面有效且在纯度方面有效：然而，迄今为止，每年仍有几百种数量级的不良事件向主管机构(例如FDA)报告，特别是在注射了基于HA的药物组合物之后。透明质酸被广泛用于各种领域和病理学：从具有保湿作用的化妆品(局部或口服)到具有持久作用的局部皮肤美容，从用于皮肤缺陷(皱纹或疤痕)(皮肤内)的矫正的注射装置，到更严格的药理学应用(例如在骨关节疾病中的关节内使用)，眼内替代玻璃体液，在膀胱内用于治疗间质性膀胱炎等。对于不接触受损组织的化妆品应用而言，化妆品级HA(纯度较低)就足够了，很明显，在制药应用中，尤其是可注射应用，甚至在封闭腔(关节和眼睛)中也是如此，需要一定程度的绝对纯度：由于从中提取透明质酸的材料的性质，实际上，最终产品中可能存在残留形式的核酸，蛋白质和/或细胞壁的残留细菌性毒素，革兰氏阳性菌(例如芽孢杆菌属，链球菌，肠球菌和葡萄球菌)，例如脂蛋白酸LTA或革兰氏阴性菌(例如埃希氏大肠杆菌，巴斯德氏菌和沙门氏菌)，例如脂多糖LPS。这些各种各样的污染物能够引起明显的炎症反应，从而在局部和全身水平释放细胞因子(尤其是TNF和IL-1)，进而引起全身性炎症反应，并在体内产生反应。整个生物体，在最严重的情况下，会导致败血性休克。LTA和LPS实际上是由脂类部分和糖类部分组成的聚合物，能够引起强烈的免疫反应，在最严重的情况下，会引起关节炎，肾炎，脑膜炎或引起发烧和休克，其后果也可能致命。这解释了如上所述报告的大量不良事件。除此之外，还应考虑到，如前所述，HA的分子量相对于来源和生产方法是可变的，并决定了其应用领域：例如，低分子量用于皮肤病学或皮肤美容制剂(约200kDa，)，而对于关节内应用，较高的MWs是优选的(通常为700至1,800kDa；)，达到的MWs高于1,500kDa，用于美容手术或眼内手术。但是，在纯化过程中，必须去除分子量低于30,000Da的HA级分，因为该级分已被广泛证明具有很强的炎症作用(EP0138572)，无论哪种应用，这都是绝对不希望的。这意味着在HA的工业纯化过程中，必须评估和控制各种因素：工艺收率：从所选的生产来源中提取最大可能量的HA是关键的；工业便利性：必须以浪费最少的所用材料(试剂，溶剂等)获得最佳产品，产生尽可能少的处理残留物并且时间要尽可能短；纯度：获得的产物必须不含任何污染物，并且也必须不含已知能够引发炎症级联反应的MW<30,000Da的HA级分。纯度显然与纯化步骤的准确性有关。针对总结的这些要求的许多尝试在现有技术中是已知的。在众多尝试中，可提及以下：EP0138572：使用，尤其是超滤步骤，添加季盐(鲸蜡基吡啶鎓)和化石树脂，用乙醇沉淀，从公鸡冠中纯化HA，并获得两个MW级分(50-100kDa和500-730kDa)，不含炎性部分；在这种情况下，超滤用于清除所有分子量小于30,000的炎性分子，并用于分离出两个所需的HA级分。EP535200：通过用季胺皂化并随后用溶剂(乙醇或丙酮)沉淀从公鸡冠中纯化HA。获得的HA具有750至1,230kDa的可变MW，无炎性级分，特别适合眼科使用。US6489467：通过用HCl加强酸化，随后改变pH和透析，从链球菌(Streptococcus)中纯化HA，获得MWs约为1,700kDa的HA；Choi等人，生物材料研究，2014，18，1-10：通过超滤和丙酮沉淀从兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)中纯化HA。获得的HA的MWs范围为900至1100kDa；EP2870255：通过过滤(去除杂质)，超滤(将产物浓缩在其所存在的溶液中中)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从发酵肉汤中，优选从链球菌(Streptococcus)或芽孢杆菌(Bacillus)属，特别是马链球菌(S.equi)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，更优选地马链球菌(S.equi)的微生物的发酵肉汤中提取和纯化HA的方法，其特征在于，它包括提取步骤，该提取步骤包含以下步骤或由以下步骤组成：/na.将过滤的肉汤用纯净水稀释至相对于初始体积的1.1至3体积，优选等于1.5的体积；/nb.在包含超滤膜的切向流过滤器(TFF)盒内强制再循环通过合并回流液和透过液形成的来自步骤a.的肉汤，所述超滤膜由芳基磺酸聚合物材料，优选聚醚砜制备，孔隙率范围为5,000至300,000道尔顿，优选50,000至200,000，甚至更优选等于100,000道尔顿，其中重复进行所述强制再循环1-6小时，优选3小时，所述再循环在没有从外部引入液体的情况下以单向流在密闭系统中以恒定体积进行。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170718 IT 102017000081449;20170718 US 62/533,7981.一种从发酵肉汤中，优选从链球菌(Streptococcus)或芽孢杆菌(Bacillus)属，特别是马链球菌(S.equi)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，更优选地马链球菌(S.equi)的微生物的发酵肉汤中提取和纯化HA的方法，其特征在于，它包括提取步骤，该提取步骤包含以下步骤或由以下步骤组成：
a.将过滤的肉汤用纯净水稀释至相对于初始体积的1.1至3体积，优选等于1.5的体积；
b.在包含超滤膜的切向流过滤器(TFF)盒内强制再循环通过合并回流液和透过液形成的来自步骤a.的肉汤，所述超滤膜由芳基磺酸聚合物材料，优选聚醚砜制备，孔隙率范围为5,000至300,000道尔顿，优选50,000至200,000，甚至更优选等于100,000道尔顿，其中重复进行所述强制再循环1-6小时，优选3小时，所述再循环在没有从外部引入液体的情况下以单向流在密闭系统中以恒定体积进行。


2.根据权利要求1的方法，其中在所述强制再循环步骤b.之后进行以下步骤：
c.用选自纯水和盐水溶液的透析溶液，优选纯水进行包含在步骤b.的TFF盒中回流液的透析I；
d.浓缩从步骤c得到的体积至起始肉汤的体积；
e.用选自纯水和盐水溶液的透析溶液，优选纯水进行从步骤d.得到的体积的透析II，重复所述透析5至15次，优选6-12次；
f.最终浓缩从步骤e.得到的体积，直到获得的最终体积等于起始肉汤的体积的三分之一；
g.通过纯水的循环进行保留在TFF盒内的产品的回收，直到获得等于起始肉汤的一半的总体积。


3.根据前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述方法的收率为85-100％，优选为95-100％。


4.根据前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述纯化的HA的总蛋白质含量＜0.1％并且细菌内毒素含量＜0.05％。


5.根据前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述发酵肉汤是马链球菌马亚种68222，突变体H-1的发酵肉汤。


6.根据前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述纯化的HA为碱金属或碱土金属的盐的形式，优选为碱金属，甚至更优选为钠盐的形式。


7.一种从发酵肉汤中，优选从链球菌(Streptococcus)或芽孢杆菌(Bacillus)属...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·科尔萨，G·卡帕尼瑟，
申请(专利权)人：费迪亚医药股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT