用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异AAV和组合物、方法及用途技术

本发明专利技术涉及腺相关病毒(AAV)血清型AAV‑Rh74和相关的AAV载体以及AAV‑Rh74和相关的AAV载体介导的基因转移方法和用途。特别是，AAV‑Rh74和相关的AAV载体将多核苷酸靶向细胞、组织或器官，用于表达(转录)编码治疗性蛋白质和肽的基因，以及用作或转录成抑制性核酸序列的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异AAV和组合物、方法及用途本申请是申请日为2014年7月22日、中国专利申请号为201480048028.0(国际申请号为PCT/US2014/047670)、专利技术名称为“用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异AAV和组合物、方法及用途”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2014年4月28日提交的美国临时申请No.61/985365和2013年7月22日提交的美国临时申请No.61/857161的优先权，所有这些申请在此通过引用整体并入本文。
由于所希望的基因不存在或其缺陷(功能丧失)或者不希望有的或有缺陷的基因的表达或者(功能增加)引起的遗传病导致多种疾病。功能丢失基因病症的一个示例是血友病，一种由凝血因子VIII(FVIII，A型血友病)或因子IX(FIX，B型血友病)缺乏造成的遗传性出血性疾病。功能增加的遗传病症的一个示例是亨廷顿病，一种由编码特别是基底神经节和大脑皮层中累积的突变蛋白并导致神经元逐渐破坏的病理性“HTT”基因(编码亨廷顿蛋白)引起的疾病。当前治疗血友病在于根据需要、在发生出血的情况下或预防性地静脉内施用重组凝血因子。然而，这种治疗方法有几个缺点，例如需要反复输注、治疗成本、发生抗治疗因子免疫反应的风险以及潜在的致命性出血的风险。这些限制已促使开发基于基因的血友病治疗。为此，血友病对基于基因转移的治疗是理想的，因为：1)治疗窗很宽，因为刚刚高于正常值1％的水平已经可导致表型从严重变至中度，并且100％的水平与任意副作用均不相关；2)治疗性转基因的组织特异性表达要求不严格；以及3)在测量治疗功效的终点方面具有相当多的经验。此外，凝血因子的肝表达已被证实诱导对凝血因子本身的免疫耐受性，从而降低了针对凝血因子的潜在的有害的免疫反应的可能性。目前，腺相关病毒(AAV)载体被认为是选择的基因转移载体，因为它们对基因在体内的递送具有最佳的安全性和疗效性能。在目前为止所分离的AAV血清型中，AAV2和AAV8已被用于靶向患有严重B型血友病的人类肝脏。两种载体均有效地工作，并且记录了治疗性转基因的AAV8长期表达的情况。人类的最近的数据表明，利用AAV载体靶向肝脏实现治疗水平的FIX转基因长期表达。尽管这些数据是有价值的，但是在人类(野生型AAV的天然宿主)中对肝脏具有高取向的AAV血清型和低血清阳性率的识别基本上用于1)以最低的载体剂量在肝脏中实现治疗水平的转基因表达以降低触发抗AAV衣壳免疫应答的风险；和2)交替具有独特的血清阳性率的AAV血清将允许治疗那些由于预先存在的抗AAV体液免疫而不符合AAV基因转移的患者群体。本专利技术解决这些需求并提供其他的益处。
技术实现思路
本专利技术提供了腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74载体以及相关的AAV载体和病毒颗粒。除其他的类型之外，这样的载体尤其包括靶向肝脏的肝细胞的AAV-Rh74。作为多核苷酸序列递送的载体，AAV-Rh74和相关的AAV载体驱动多核苷酸在细胞中表达。编码蛋白质例如用于治疗应用的蛋白质的多核苷酸能在施用后以治疗水平进行表达。示例性的AAV-Rh74和相关的AAV载体包括AAV-Rh74变体。具体的衣壳变体包括在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的195、199、201或202氨基酸位中的任一个上具有氨基酸替代(substitution)的Rh74衣壳序列。在具体的方面，所述残基对应于RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的195、199、201或202氨基酸位中的任一个上的A、V、P或N氨基酸。在更具体的方面，所述衣壳序列具有在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195氨基酸位的A残基；第199氨基酸位的V残基，第201氨基酸位的P残基，或第202氨基酸位的N残基。在进一步更具体的方面，所述衣壳序列具有以下的任意两个、三个或全部四个：在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195氨基酸位的A残基；第199氨基酸位的V残基，第201氨基酸位的P残基，或第202氨基酸位的N残基。本专利技术的重组AAV颗粒包括任意衣壳变体例如RHM4-1(SEQIDNO:5)、RHM15-1(SEQIDNO:6)、RHM15-2(SEQIDNO:7)、RHM15-3/RHM15-5(SEQIDNO:8)、RHM15-4(SEQIDNO:9)或RHM15-6(SEQIDNO:10)的AAV衣壳序列。在具体的实施方式中，重组AAV颗粒被衣壳化或包装载体基因组(例如，病毒载体，如AAV载体基因组)。这样的本专利技术的重组AAV颗粒包括病毒(例如，AAV)载体基因组，其还包括异源多核苷酸序列。AAV-Rh74和相关的AAV载体介导的多核苷酸转移所产生的蛋白表达水平，该蛋白表达水平比目前临床前和临床环境中研究的几种其他血清型显著更高。特别是，AAV-Rh74在小鼠和B型血友病狗中以至少相当或优于AAV8肝转导金标准的效率将多核苷酸靶向肝脏(参见例如图1和2)。AAV-Rh74变体比如例如衣壳变体RHM4-1(SEQIDNO:5)在小鼠中以相当或优于AAV8和优于Rh74AAV的效率将多核苷酸靶向肝脏(参见例如图5)。此外，非人灵长类的数据表明AAV-Rh74和AAV-Rh74变体例如RHM4-1在介导hFIX的肝脏来源的表达时比AAV8的效力高约两倍(参见例如图4和6)。因此，AAV-Rh74和AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1)可用于递送多核苷酸例如基因编码序列以表达提供理想的或治疗有益效果的蛋白质，以及用于减少或抑制不期望有的或有缺陷的基因的表达从而治疗多种疾病的抑制性核苷酸。例如，AAV-Rh74和AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1)可用作载体以递送至细胞、组织和器官例如肝治疗基因(例如，FIX、FVIII)以治疗A型血友病、B型血友病等。这样的AAV-Rh74和AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1)载体也可用于递送用于广泛的其他代谢或血浆蛋白缺陷或用于其他治疗目的的基因，例如但不限于编码锌指核酸酶的基因以在肝进行基因组编辑，和用于局部(肝)递送免疫调节剂例如α-干扰素以用于治疗肝炎病毒感染，或实际上治疗需要肝转导或血流中存在治疗性转基因产物(其可通过靶向转基因用于肝表达来实现)的任意疾病。除了通过AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体比如衣壳变体(例如，RHM4-1)将多核苷酸经体外、离体和体内有效递送到细胞内之外，抗AAV-Rh74抗体在人类中的患病率比抗AAV2抗体的低，并且不同于抗AAV8抗体(表1)。由于低血清阳性率，AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74(衣壳)变体(例如，RHM4-1)可以较大的百分比用在人类中，否则将不适用于例如可能对其他AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11等)是血清阳性的人类的基因转移。此外，AAV-Rh74和相关载体例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AAV衣壳序列，其中所述序列在RH74 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)的第195、199、201或202氨基酸位中的任一个上具有氨基酸替代，或在RH74 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)中具有精氨酸替代赖氨酸的氨基酸替代。/n

【技术特征摘要】
20130722 US 61/857,161;20140428 US 61/985,3651.一种AAV衣壳序列，其中所述序列在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195、199、201或202氨基酸位中的任一个上具有氨基酸替代，或在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)中具有精氨酸替代赖氨酸的氨基酸替代。


2.根据权利要求1所述的AAV衣壳序列，其中所述残基对应于RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195、199、201或202氨基酸位中的任一个上的A、V、P或N氨基酸。


3.根据权利要求1所述的AAV衣壳序列，其中所述序列在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195氨基酸位具有A残基；在第199氨基酸位具有V残基；在第201氨基酸位具有P残基；或在第202氨基酸位具有N残基。


4.根据权利要求1所述的AAV衣壳序列，其中所述序列具有在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195氨基酸位的A残基；在第199氨基酸位的V残基；在第201氨基酸位的P残基；或在第202氨基酸位的N残基中的任意两个。


5.一种重组AAV颗粒，其包括根据权利要求1至4中任一项所述的AAV衣壳序列或RHM4-1(SEQIDNO:5)、RHM15-1(SEQIDNO:6)、RHM15-2(SEQIDNO:7)、RHM15-3/RHM15-5(SEQIDNO:8)、RHM15-4(SEQIDNO:9)或RHM15-6(SEQIDNO:10)。


6.一种重组AAV颗粒，其包括根据权利要求1至4中任一项所述的AAV衣壳序列或RHM4-1(SEQIDNO:5)、RHM15-1(SEQIDNO:6)、RHM15-2(SEQIDNO:7)、RHM15-3/RHM15-5(SEQIDNO:8)、RHM15-4(SEQIDNO:9)或RHM15-6(SEQIDNO:10)，其中所述颗粒衣壳化载体基因组。


7.一种重组AAV颗粒，其包括根据权利要求1至4中任一项所述的AAV衣壳序列或RHM4-1(SEQIDNO:5)、RHM15-1(SEQIDNO:6)、RHM15-2(SEQIDNO:7)、RHM15-3/RHM15-5(SEQIDNO:8)、RHM15-4(SEQIDNO:9)或RHM15-6(SEQIDNO:10)，其中所述颗粒衣壳化AAV载体基因组。


8.一种用于将异源多核苷酸序列递送或传送到哺乳动物或哺乳动物细胞中的方法，其包括向所述哺乳动物或所述哺乳动物细胞施用包括含有异源多核苷酸序列的重组载体基因组的重组AAV颗粒，从而将所述异源多核苷酸序列递送或传送到所述哺乳动物或所述哺乳动物细胞中。


9.一种治疗蛋白质表达或功能缺陷的哺乳动物的方法，其包括：(a)提供包括含有编码能纠正蛋白表达或功能缺陷的多肽的异源多核苷酸序列的重组载体基因组的重组AAV颗粒，其中所述异源多核苷酸序列能操作地连接在赋予所述异源多核苷酸序列转录的表达调控元件上；和(b)向哺乳动物施用一定量的所述重组AAV颗粒，其中所述多肽在所述哺乳动物中表达。


10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述重组AAV颗粒包括与下述序列具有90％或90％以上序列同一性的VP1序列：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHL...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯瑟琳·A·海，穆斯塔法·N·亚兹乔鲁，泽维尔·安谷拉，
申请(专利权)人：费城儿童医院，
类型：发明
国别省市：美国;US