基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及基于CRISPR‑Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法。根据ASGV保守序列设计出crRNA，并制作用于比色检测的AuNP‑DNA，探究Cas12a蛋白体外切割反应时间和linker DNA浓度对检测效果的影响，建立最佳ASGV可视化检测体系及检测方法，该方法为恒温反应条件，并通过CRISPR‑Cas12a‑crRNA复合体识别病毒来提高特异性，且linker DNA具有通用性，不需要昂贵的双标记探针，借助低速离心可在40 min内检测多个样本，其检测下限为5.62×10

Visual detection system and detection method of Apple stem ditch virus based on crispr-cas12a Technology

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种苹果茎沟病毒的检测方法，特别是指基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法。
技术介绍
苹果（Malusdomesica）是世界栽培面积和产量最大的水果之一，主要种植于世界温带地区，具有很高的商业价值。2018——2019年世界苹果总产量预计为6860.0万t，中国苹果总产量预计将达3100.0万t。同时，苹果产业面临着严重的苹果病毒病问题，目前已知苹果病毒病17种，其中以ACLSV、ASPV、ASGV等潜隐性病毒在我国发生较为普遍，危害较大。潜隐性病毒通常不表现明显症状，但是树体感病后会减少16%-36%的生长量，降低17.0%-73.7%产量，同时降低苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用，使得施肥量增多30%-40%，对苹果品质和产量造成严重损害。长期以来，由于人们对潜隐病毒缺乏认识，且在栽培中无法辨别铲除，致使苹果潜隐性病毒病的发生危害不断扩大。苹果病毒病尚无有效的化学或生物制剂，一旦感染，终身带毒，长期受害。嫁接是苹果病毒传播的主要途径，因此繁殖无病毒苗木，加强苗木和园区树体的病毒检疫，是防治病毒病的唯一途径和根本保障。传统上，苹果病毒常采用指示植物法和酶联免疫吸附法进行检测。随着分子生物学发展，以核苷酸为基础的分子检测技术，如聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）等，已在苹果主要病毒的检测中得到广泛采用。专利CN201510051864.0提供的检测方法，采用感病材料的cDNA为模板，通过特异性引物扩增出产物，该产物再通过载体连接以及转化之后，挑取阳性克隆扩繁培养并进行质粒提取和鉴定（酶切鉴定）进而获得阳性重组质粒标准品。PCR检测特异性强，准确性高，然而这种方法繁琐，不仅需要相关专业操作培训，还需采购PCR仪、照胶仪等体积较大、价格昂贵的设备。CRISPR-Cas技术是一种最新涌现的基因组编辑技术，具有很强的靶标特异性，最近研究发现，cas12a蛋白在识别靶标后可以激发反式切割活性，及对体系中任意单链DNA进行不加区别的切割。利用这一特性已经开发出了通过观测荧光信号，来检测人类乳头状瘤病毒（HPV）并且能精确的区分其中两个亚型。同时，张峰团队将CRISPR技术与横向流动试纸条结合，开发出了可在2h之内检测出寨卡病毒（ZIKV）和登革热（DHF）的试纸条。除病毒之外，CRISPR已经应用于检测肠道微生物，通过粪便可以精确检测出艰难梭菌（Clostridiumdifficile）。但是，基于CRISPR的检测方法运用荧光检测时耗费大量时间且需要酶标仪等大型设备，随后开发的依靠试纸条的可视化检测虽然简便，但是需要添加大量昂贵的荧光探针才能观测，成本较高。纳米金颗粒（AuNPs）比色检测是一种更加简单且廉价的检测形式，通过AuNPs的聚集将吸收峰移动到更长的波长，并将胶体溶液的颜色从红色变为紫色。因此可以采用纳米金颗粒（AuNPs）作为显色剂，结合CRISPR-Cas12a技术研发一种以苹果组织粗提液为模板的高效、低成本的病毒检测方法。
技术实现思路
为解决上述现有检测苹果病毒方法中存在的问题，本专利技术提出一种基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法。本专利技术的技术方案是这样实现的：基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，所述检测体系包含Cas12a蛋白、crRNA、LinkerDNA、AuNP-DNA复合物和NEBuffer2.1。所述AuNP-DNA复合物的制备方法为：（1）向200μL的13nmAuNP溶液中加入2μL的1wt%Tween20和10μL的4μMmPEG-SH，得混合溶液；（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入10μL100μM硫醇化DNA1，并加入50μL4MNaCl，室温下老化60min，得处理液；（3）将处理液置于离心机中4℃14000rpm离心10min除去上清液，得沉淀；（4）用PBST溶液重悬步骤（3）的沉淀，反复离心重悬三次后加入200μLPBST溶液得到AuNP-DNA1；（5）参照步骤（1）-（4）制备AuNP-DNA2；（6）将AuNP-DNA1和AuNP-DNA2各取5μL混合，向混合液加入2.8μL4MNaCl溶液，得到用于比色检测的AuNP-DNA复合物。所述步骤（1）中13nmAuNP溶液的物质的量浓度为0.1mg/mL。所述步骤（2）中DNA1序列如SEQIDNO.1所示，DNA2序列如SEQIDNO.2所示。所述crRNA的制备方法为：以ASGV-T7-crRNA-F和ASGV-crRNA-R为引物，经PCR后回收产物并进行反转录得crRNA；其中ASGV-T7-crRNA-F序列如SEQIDNO.4所示、ASGV-crRNA-R序列如SEQIDNO.5所示。所述LinkerDNA序列如SEQIDNO.3所示。所述的苹果茎沟病毒可视化检测体系的检测方法，步骤如下：①将Cas12a蛋白和crRNA混合后，加入14.5μLNEBuffer2.1，在37℃加热仪器中温浴5min进行预组装；②向步骤①的反应管中加入linkerDNA和待测样品，在37℃加热仪器上温浴30min；③取5μL步骤②的反式切割产物加入到AuNP-DNA复合物溶液中；④在室温下静置10min后，用微型离心机离心1min，观察结果，颜色保持红色不变即为阳性，颜色变为粉色即为阴性。所述步骤①中Cas12a蛋白的浓度为1μM、用量为4μL，crRNA的浓度为10μM、用量为0.5μL。所述步骤②中linkerDNA的浓度为10μM、用量为0.5μL，待测样品的量为0.5μL。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术将CRISPR技术和AuNP-DNA结合用于检测ASGV，通过制备价格低廉的AuNP-DNA复合物溶液，并依靠cas12a-crRNA蛋白复合体识别病毒序列后对linkerDNA进行切割，阻止AuNP-DNA发生交联反应，实现对ASGV的可视化检测。本专利技术不需要昂贵的双标记探针，且制备的linkerDNA具有通用性，适用于对任何病毒进行检测，且在等温反应条件，40min之内就可以完成对大量样本的检测。2、本专利技术建立了一种基于CRISPR-Cas12a技术和AuNP-DNA复合物来快速检测ASGV的方法。该方法为恒温反应条件，并通过CRISPR-cas12a-crRNA识别来提高特异性，且linkerDNA具有通用性，不需要昂贵的双标记探针，借助低速离心可在40min内检测多个样本，其检测下限为5.62×102copies/反应，灵敏度比RT-PCR高100倍。在对51份田间样品进行检测时，该方法与RT-PCR相比阳性检出率一致率为98.04%，一致率高，具有良好的特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述检测体系包含Cas12a蛋白、crRNA、Linker DNA、AuNP-DNA复合物和NEBuffer 2.1。/n

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述检测体系包含Cas12a蛋白、crRNA、LinkerDNA、AuNP-DNA复合物和NEBuffer2.1。


2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于，所述AuNP-DNA复合物的制备方法为：
（1）向200μL的13nmAuNP溶液中加入2μL的1wt%Tween20和10μL的4μMmPEG-SH，得混合溶液；
（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入10μL100μM硫醇化DNA1，并加入50μL4MNaCl，室温下老化60min，得处理液；
（3）将处理液置于离心机中4℃14000rpm离心10min除去上清液，得沉淀；
（4）用PBST溶液重悬步骤（3）的沉淀，反复离心重悬三次后加入200μLPBST溶液得到AuNP-DNA1；
（5）参照步骤（1）-（4）制备AuNP-DNA2；
（6）将AuNP-DNA1和AuNP-DNA2各取5μL混合，向混合液加入2.8μL4MNaCl溶液，得到用于比色检测的AuNP-DNA复合物。


3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述步骤（1）中13nmAuNP溶液的物质的量浓度为0.1mg/mL。


4.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述步骤（2）中DNA1序列如SEQIDNO.1所示，DNA2序列如SEQIDNO.2所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：郑先波，焦健，冯建灿，黄松，孔康康，韩金蒙，夏炎，白团辉，宋春晖，王苗苗，宋尚伟，陈海燕，张英丽，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41