一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法技术

本发明专利技术涉及一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，首先重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His‑tag抗体捕获，对于色度信号，可直接再自然光源下用相机拍照，对于荧光信号，将试纸条放置于多功能成像仪中拍照，随后对图像进行分析及结果判定。本发明专利技术提供的方法利用噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白为荧光供体，以抗氯噻啉抗体偶联的胶体金颗粒为荧光受体，根据荧光内滤效应，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的检测。本发明专利技术灵敏度高、快速、简便、经济、实用性强，可以对小分子的定量、在线检测。

A double signal side flow immunochromatographic method for the detection of chlorothialine

The invention relates to a double signal side flow immunochromatographic detection method for chlorothialine. First, the recombinant tracer competes with the analyte to compete for the binding site of the antibody of the analyte coupled on the colloidal gold, and then the recombinant tracer is captured by the anti his \u2011 tag antibody. For the chromaticity signal, it can be directly connected to the natural light source and photographed with a camera. For the fluorescent signal, the test strip is placed on the multifunctional Take photos in the imager, then analyze the images and determine the results. The method of the invention uses the recombinant protein of phage display peptide mimic epitope and enhanced green fluorescent protein as the fluorescent donor, the colloidal gold particle coupled with anti chlorothialine antibody as the fluorescent receptor, and realizes the detection of small fraction compounds by side flow chromatography according to the fluorescent internal filtering effect. The invention has the advantages of high sensitivity, fast speed, simplicity, economy and strong practicability, and can be used for quantitative and online detection of small molecules.

【技术实现步骤摘要】
一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析方法，利用噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白为荧光供体，利用分析物抗体偶联的胶体金做为荧光受体，根据荧光内滤效应，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的在线、定量及高敏感性检测。
技术介绍
氯噻啉是我国自主研发的新烟碱类杀虫剂，广泛用于防治小麦、水稻、果树和蔬菜等作物上的害虫。然而，过量的使用使其广泛分布于水体和农产品中，对非靶标生物如蜜蜂等造成了潜在的威胁。因此，建立简单、快速、灵敏的检测方法监测环境和农产品中氯噻啉残留是保障环境和农产品安全的重要抓手。噬菌体展示随机多肽库已广泛应用于免疫检测，病原细菌检测，细胞成像等领域。在小分子免疫分析中，噬菌体展示随机肽的主要有两个用途：1)筛选模拟表位代替化学半抗原或分析物，开发竞争型免疫分析；2)筛选抗免疫复合体，其能与抗原-抗体的复合物结合，开发非竞争型免疫分析。噬菌体展示随机多肽容易获得且在分析中具有较高的敏感性。然而，由于噬菌体颗粒的尺寸较大(880×6-7nm)，流动性较差，限制了噬菌体展示肽的应用。使得噬菌粒展示多肽技术不适合用于开发快速检测。另一方面，噬菌体不是一种常规的生产试剂，作为商业试剂使用可能存在不同批次间的差异，长期储存的稳定性和其生物安全性也进一步限制了其应用。为了克服这些缺陷，通过化学方式合成噬菌体展示的多肽，并与载体蛋白，纳米颗粒或者链霉亲和素偶联，已经被用于开发无噬菌体的小分子免疫分析，但化学合成代价较高，合成后仍需标记。并不适合大量生产。将多肽与蛋白质融合表达制备重组蛋白，则可通过细菌发酵来实现大量的生产，大大降低成本。而且，如果与多肽融合的蛋白是荧光蛋白，那么这种重组蛋白则又可以直接作为示踪物，避免了标记步骤。荧光内滤效应是当荧光供体的发射光谱与荧光受体的吸收光谱重叠时，受体对供体发射荧光重吸收，导致荧光强度减弱的现象。目前，基于荧光内滤效应的免疫分析方法已被应用小分子，蛋白质，核酸等的检测。增强型绿色荧光蛋白为绿色荧光蛋白的突变体，在光稳定性和光强度方面的性能被大大提高，且容易在大肠杆菌中表达，是一种理想的蛋白类荧光供体。胶体金是通过弱还原剂还原氯金酸中的金离子，制备的一种纳米颗粒，已被广泛应用于免疫层析试纸条。胶体金合成简单，成本较低，性质稳定，吸收光谱宽，且易于和各种生物大分子偶联，是一种理想的荧光受体。以噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白(在C端带有一个His标签)为荧光供体，利用分析物抗体偶联的胶体金颗粒做为荧光受体，开发一种双信号(色度信号和荧光信号)侧流免疫层析方法。色度信号由胶体金产生，荧光信号由重组蛋白产生。当分析物浓度增高时，与重组蛋白结合的胶体金减少，使得检测线处的色度信号降低，色度信号与分析物浓度呈负相关；同时，由于荧光内滤效应，重组蛋白的荧光强度得以恢复，荧光信号与分析物浓度呈正相关。该专利技术为食品安全检测、农产品等的出入境检测、环境监测部门的监测提供有效的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。目前，国内外尚未见有基于模拟表位多肽与荧光蛋白重组表达示踪物的双信号侧流免疫层析方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新颖、快速、灵敏的双信号侧流免疫层析系统，以多肽模拟表位重组示踪物(在本说明书中使用增强型绿色荧光蛋白(EmGFP)与氯噻啉多肽模拟表位C2-15融合表达，在C端带有一个His标签)为荧光供体，以抗氯噻啉抗体偶联的胶体金颗粒为荧光受体，根据荧光内滤效应，以实现对小分子的定量、在线检测。本专利技术提供的一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析方法，包括：1.一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析方法，其特征包括：第一步：重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His-tag抗体捕获，硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS稀释的抗His-tag抗体(4.0mg/mL)和羊抗鼠IgG抗体(1.0mg/mL)分别作为检测(test，T)线和控制(control，C)线，以1μL/cm的速度喷在NC膜上。将NC膜在37℃下干燥1小时。将分析物抗体标记的胶体金溶液以34μL/cm的速度喷在结合垫(玻璃纤维垫，已用含1mg/mLBSA的PBS溶液处理)上。然后将NC膜，结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3.5mm宽，在室温下储存备用；加样：将75μL的样品与75μL的重组示踪物：SEQIDNo.1所示序列(含有4μg蛋白质，0.5％吐温20)混合，将混合物滴到样品垫上，并流过膜15分钟；第二步：NC膜上的双信号的检测，色度信号：将试纸条置于自然光源下，用相机直接拍照。荧光信号：将试纸条置于多功能成像仪中，设置激发波长为470nm，滤光片为535nm，用成像仪自带相机拍照。第三步：检测结果的分析及结果判定，方法1：将图片导入imageJ1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均灰度/光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均灰度/光密度值，以校正后的灰度/光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量；方法2：用肉眼直接观察在自然光源和多功能成像仪中拍摄的图像。相对阴性对照的结果：在自然光源下拍摄的图片，若T线区域颜色未消失为阴性，若无条带则为阳性；在多功能成像仪中拍摄的图片，若T线区域未出现绿色荧光为阴性，若T线区域出现明显绿色荧光为阳性。本专利技术技术方案实现的有益效果：1.灵敏度高：应用于氯噻啉的检测，本方法的定性检测线为8.00ng/mL，比基于相同抗体的传统胶体金免疫层析方法提高了62.5倍。本方法的定量检测限为3.21ng/mL，比基于相同抗体的传统酶联免疫吸附分析法提高了5.5倍；2.经济实用：重组示踪物可通过细菌发酵大量产生，降低了检测成本；3.结果直观：重组示踪物提供的荧光信号与氯噻啉浓度呈正相关，使得结果更加直观，易理解。4.新颖度高：目前，国内外尚未见有基于模拟表位多肽与荧光蛋白重组表达示踪物的双信号侧流免疫层析方法的报道。附图说明图1为本专利技术技术方案的原理示意图；图中“1”表示氯噻啉；“2”表示重组示踪物；“3”表示抗氯噻啉抗体偶联的胶体金颗粒；“4”表示T线；“5”表示C线；“6”表示吸水垫；“7”表示样品垫；“8”表示结合垫；“9”表示重组示踪物的激发光；“10”表示重组示踪物的发射光；“11”表示荧光内滤效应；“12”表示典型阳性结果图；“13”表示典型阴性结果图；图2为本专利技术在自然光下和多功能成像仪中对不同浓度氯噻啉标准品溶液的检测图像；图3为本专利技术对氯噻啉标准品检测的标准曲线；图4为本专利技术对氯噻啉添加样品的检测图像。具体实施方式以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，其特征包括：/n第一步：重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His-tag抗体捕获，/n硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS稀释的抗His-tag抗体(4.0mg/mL)和羊抗鼠IgG抗体(1.0mg/mL)分别作为检测(test，T)线和控制(control，C)线，以1μL/cm的速度喷在NC膜上。将NC膜在37℃下干燥1小时。将分析物抗体标记的胶体金溶液以34μL/cm的速度喷在结合垫(玻璃纤维垫，已用含1mg/mL BSA的PBS溶液处理)上。然后将处理好的NC膜，结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3.5mm宽，在室温下储存备用；加样：将75μL的样品与75μL的重组示踪物：SEQ ID No.1所示序列(含有4μg蛋白质，0.5％吐温20)混合，将混合物滴到样品垫上，并流过膜15分钟；/n第二步：NC膜上的双信号的检测，/n色度信号：将试纸条置于自然光源下，用相机直接拍照。/n荧光信号：将试纸条置于多功能成像仪中，设置激发波长为470nm，滤光片为535nm，用成像仪自带相机拍照。/n第三步：检测结果的分析及结果判定，/n方法1：将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均灰度/光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均灰度/光密度值，以校正后的灰度/光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量；/n方法2：用肉眼直接观察在自然光源和多功能成像仪中拍摄的图像。相对阴性对照的结果：在自然光源下拍摄的图片，若T线区域颜色未变淡为阴性，若无条带则为阳性；在多功能成像仪中拍摄的图片，若T线区域未出现绿色荧光为阴性，若T线区域出现明显绿色荧光为阳性。/n...

【技术特征摘要】
20190508 CN 20191038724611.一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，其特征包括：
第一步：重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His-tag抗体捕获，
硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS稀释的抗His-tag抗体(4.0mg/mL)和羊抗鼠IgG抗体(1.0mg/mL)分别作为检测(test，T)线和控制(control，C)线，以1μL/cm的速度喷在NC膜上。将NC膜在37℃下干燥1小时。将分析物抗体标记的胶体金溶液以34μL/cm的速度喷在结合垫(玻璃纤维垫，已用含1mg/mLBSA的PBS溶液处理)上。然后将处理好的NC膜，结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3.5mm宽，在室温下储存备用；加样：将75μL的样品与75μL的重组示踪物：SEQIDNo.1所示序列(含有4μg蛋白质，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：华修德，王鸣华，丁园，陈贺，孙娜娜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32