检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法技术

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人PML‑RARa融合基因的试剂盒。本申请的采用PCR结合实时荧光探针技术，对临床外周血标本中的白血病相关融合基因PML‑RARa的RNA进行定量检测，从而辅助白血病临床诊断并指导相关白血病患者对临床药物的选择，具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势。

Kit for detection of human PML-RARA fusion gene and its application

The application relates to the field of fusion gene detection, in particular to a kit for detecting human PML \u2011 rara fusion gene. In this application, PCR combined with real-time fluorescent probe technology is used to quantitatively detect the RNA of PML-RARA in clinical peripheral blood samples, so as to assist the clinical diagnosis of leukemia and guide the selection of clinical drugs for related leukemia patients, which has the technical advantages of high specificity, high accuracy and minimum detection amount.

【技术实现步骤摘要】
检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法
本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根据白血细胞的形态和生化特征，又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒－单核细胞白血病(CMML)等。白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为2.76/10万人口，我国估计有5万以上患者，且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位，但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第1位。近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以，对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此，世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。t(15；17)(q22；q12-21)易位，即15号染色体上的PML基因易位到17号染色体上的RARa基因上形成PML-RARa融合基因，约90％以上的APL患者中可检测到此融合基因，可作为APL诊断依据、疗效评价，以及监测白血病微小残留状态的分子指标。目前对白血病的检查主要有血象检查、骨髓涂片检查、血液生化检查等，但这些都没有对融合基因进行检查，获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR和基因芯片等。其中，FISH技术是利用已知的核酸探针，与组织、细胞染色体标本中相关核酸序列杂交，通过间接免疫荧光反应，直接定位基因，适用于多种临床标本，包括血液，骨髓、组织印片，甚至石蜡包埋的组织标本。由于FISH对处于分裂中期和间期细胞都能检测，克服了常规的细胞遗传学诊断淋巴瘤和白血病必须细胞处于分裂中期的障碍，但最低检出量较低，主要用于初诊和复发的检测。PCR是检测融合基因的首选方法，不同类型的白血病和淋巴瘤存在不同的染色体易位，目前检测融合基因的主要PCR方法有巢式PCR方法，但这些大多是终点PCR方法，而且需要经过电泳检查，容易污染，极大地抑制了其在临床的广泛应用。基因芯片方法是将许多白血病特异的探针固定在特定的介质上，利用分子之间相互识别的原理，来检测与探针相互作用的分子。通过基因芯片检查，可以发现病人骨髓中是否存在染色体易位。但目前该技术尚不够成熟，尤其是在PCR后的开管取样用于杂交，对其后的PCR反应，存在着很大的污染隐患，因此有一定的假阳性和假阴性率，且结果不容易解释，临床推广困难。在荧光定量PCR技术普及前，很多研究学者采用竞争性定量PCR技术对融合基因进行定量分析，但竞争性定量PCR不仅耗时耗力，而且不利于标准化操作的建立，极大限制了其在临床上的应用。实时定量PCR(real-timequantitativePCR，RQ-PCR)基于荧光能量传递技术(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)，通过检测PCR过程的荧光信号而得知靶基因的初始拷贝数。实时定量PCR应用简化了检测过程，其反应速度快，最低检出量高，特异性强，可重复性好，是目前国内外学者研究白血病融合基因首选的检测手段。2002年，由欧洲10个国家26个实验室共同参与制定了“欧洲防癌计划”，建立了一套白血病标准化的融合基因检测方法，为大规模的临床融合基因检测奠定了理论基础，但因为缺乏中国患者的数据，未能在中国大规模应用。鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
本申请的专利技术目的在于提出一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒。为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：本申请涉及一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括PML-RARaPCR反应液和内参PCR反应液；其中，所述PML-RARaPCR反应液用于检测PML-RARa融合基因，所述内参PCR反应液用于检测内参基因；其中，所述用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针包括由SEQIDNO:1～SEQIDNO:3所示的上游引物、由SEQIDNO:4所示的下游引物、由SEQIDNO:5所示的探针；所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQIDNO:6所示的上游引物、由SEQIDNO:7所示的下游引物、由SEQIDNO:8所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。可选的，SEQIDNO:5所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA，SEQIDNO:8所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。可选的，所述核酸扩增试剂中还包括PML-RARa酶液，所述PML-RARa酶液包括Taq酶和UNG酶。可选的，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为质粒混合液，所述质粒混合液中含有PML-RARA-L质粒DNA和内参质粒DNA；其中，PML-RARA-L质粒DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示。可选的，所述试剂盒中还包括参考品，所述参考品用于形成目的基因和内参基因的标准曲线从而对目的基因和内参基因分别进行定量，所述参考品包括PML-RARa参考品1、PML-RARa参考品2、PML-RARa参考品3、PML-RARa参考品4、内参参考品1、内参参考品2、内参参考品3和内参参考品4；所述PML-RARa参考品1、所述PML-RARa参考品2、所述PML-RARa参考品3和所述PML-RARa参考品4中含有PML-RARA-L质粒DNA，所述内参参考品1、所述内参参考品2、所述内参参考品3和所述内参参考品4中含有内参质粒DNA；其中，所述PML-RARa参考品1中的质粒浓度为1×106copies，所述PML-RARa参考品2中的质粒浓度为1×105copies，所述PML-RARa参考品3中的质粒浓度为1×104copies，所述PML-RARa参考品4中的质粒浓度为1×103copies，所述内参参考品中的质粒浓度为1×106copies，所述内参参考品2中的质粒浓度为1×105copies，所述内参参考品3中的质粒浓度为1×104copies，所述内参参考品4中的质粒浓度为1×103copies；其中，PML-RAR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括PML-RARa PCR反应液和内参PCR反应液；/n其中，所述PML-RARa PCR反应液用于检测PML-RARa融合基因，所述内参PCR反应液用于检测内参基因；/n所述用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的上游引物、由SEQ ID NO:4所示的下游引物、由SEQ ID NO:5所示的探针；/n所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:6所示的上游引物、由SEQ IDNO:7所示的下游引物、由SEQ ID NO:8所示的探针；/n所述探针的两端标记有荧光基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括PML-RARaPCR反应液和内参PCR反应液；
其中，所述PML-RARaPCR反应液用于检测PML-RARa融合基因，所述内参PCR反应液用于检测内参基因；
所述用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针包括由SEQIDNO:1～SEQIDNO:3所示的上游引物、由SEQIDNO:4所示的下游引物、由SEQIDNO:5所示的探针；
所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQIDNO:6所示的上游引物、由SEQIDNO:7所示的下游引物、由SEQIDNO:8所示的探针；
所述探针的两端标记有荧光基团。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQIDNO:5所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA，SEQIDNO:8所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括PML-RARa酶液，所述PML-RARa酶液中包括Taq酶和UNG酶。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为质粒混合液，所述质粒混合液中含有PML-RARA-L质粒DNA和内参质粒DNA；
其中，PML-RARA-L质粒DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示、内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括参考品，所述参考品用于形成目的基因和内参基因的标准曲线从而对目的基因和内参基因分别进行定量，所述参考品包括PML-RARa参考品1、PML-RARa参考品2、PML-RARa参考品3、PML-RARa参考品4、内参参考品1、内参参考品2、内参参考品3和内参参考品4；
所述PML-RARa参考品1、所述PML-RARa参考品2、所述PML-RARa参考品3和所述PML-RARa参考品4中含有PML-RARA-L质粒DNA，所述内参参考品1、所述内参参考品2、所述内参参考品3和所述内参参考品4中均含有内参...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，谢立群，徐任，陆孟超，陈嘉铮，李云航，高峰英，
申请(专利权)人：苏州云泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32