检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法技术

本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法。本申请的试剂盒对人Kras基因的第2号、第3号外显子和Nras基因第3号外显子的相关突变进行定性检测，用于指导爱必妥、帕尼单抗等EGFR抗体药物的靶向用药，从而降低医生治疗风险以及患者经济负担。

A kit for detecting mutation of human ras gene and its application

The application relates to the field of gene mutation detection, in particular to a kit for detecting human ras gene mutation and a method for using the kit. The kit of this application is used for qualitative detection of mutations related to exon 2 and 3 of human KRAS gene and exon 3 of NRAS gene, to guide the targeted drug use of EGFR antibody drugs such as ibital and panimab, so as to reduce the treatment risk of doctors and the economic burden of patients.

【技术实现步骤摘要】
检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法
本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
大量临床研究资料证实，Kras基因突变状态与针对EGFR的药物，如Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等的疗效有关，因此Kras基因突变检测已被写入最新版的《NCCN结直肠癌临床实践指南》，所有转移性结直肠癌患者都应检测Kras基因状态，只对Kras基因野生型患者推荐介绍抗EGFR药物治疗。2013年ESMO上更新了PRIME研究的最新数据，提示在使用帕尼单抗或者说抗EGFR单抗治疗转移性结直肠癌患者前，不仅需要检测Kras基因的突变热点第2外显子，还要检测其他外显子和Nras基因。经过这样更精细检测和挑选的患者，才是帕尼单抗联合化疗最大的获益人群。目前基因突变检测常用的方法有以下几种：1、核苷酸序列测定技术：是基因突变的经典检测方法，也是检测基因突变的金标准，目前国内外报道的EGFR基因突变的检测不少采用DNA测序法，该方法可靠直观，并可检测出多位点的变异。2、聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术：PCR-RFLP是在RFLP分析方法的基础上发展建立的一种更为简便的DNA分型技术。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。PCR结合RFLP分析技术能有效地鉴别野生株和变异株，实验简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验使用，但灵敏度不够，易污染，并且不可发现新的位点变异。3、基因芯片技术：基因芯片(genechip)，又称基因微矩阵(microarray)，其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取样品分子的数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究.基因芯片技术由于其具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因的优势，已在生物学的各个领域中得到广泛的应用。但由于目前技术还不够成熟，所以有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点的变异。4、变性高效液相色谱(DHPLC)技术：DHPLC技术是一种高通量、主动化的基因突变检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展，与SSCP和DNA直接测序等突变检测技巧相比，DHPLC具有敏锐性更高，特异性更强，便宜省时等优点。但缺点也很明显，如可判断有否突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证，而且仪器价格昂贵，也制约了在临床的开展。鉴于此，为了对人Kras基因的相关突变进行定性检测，用于指导Cetuximab(爱必妥)、Panitumumab(帕尼单抗)等EGFR抗体药物的靶向用药，特提出本申请。
技术实现思路
本申请的专利技术目的在于提出一种检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法。为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：本申请涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5和Ras内参基因反应液；其中，所述Ras基因反应液1用于检测Kras基因第2号外显子，所述Ras基因反应液3用于检测Kras基因第3号外显子的基因突变，所述Ras基因反应液5用于检测Nras基因第3号外显子，所述Ras内参基因反应液用于检测内参基因；其中，所述Ras基因反应液1中包括由SEQIDNO:11、SEQIDNO:12所示的上游引物、由SEQIDNO:13所示的下游引物、由SEQIDNO:14所示的探针、由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:23所示的内控探针；所述Ras基因反应液3中包括由SEQIDNO:1所示的上游引物、由SEQIDNO:2～SEQIDNO:9所示的下游引物、由SEQIDNO:10所示的探针、由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:23所示的内控探针；所述Ras基因反应液5中包括由SEQIDNO:15～SEQIDNO:17所示的上游引物、SEQIDNO:18所示的下游引物、由SEQIDNO:19所示的探针、由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:23所示的内控探针；所述Ras内参基因反应液中包括由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:22所示的内参基因探针；所述探针的两端标记有荧光基团。可选的，SEQIDNO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。可选的，所述核酸扩增试剂中还包括Ras基因MIX3反应液，所述Ras基因MIX3反应液中含有Taq酶、UNG酶和dNTPs。可选的，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有Ras基因突变质粒以及内参质粒，所述Ras基因突变质粒选自Kras-G12A、Kras-G12R、Kras-G12D、Kras-G12C、Kras-G12S、Kras-G12V、Kras-G13C、Kras-G13D、Kras-Q61R、Kras-Q61L、Kras-Q61H1、Kras-Q61H2、Nras-Q61K、Nras-Q61R、Nras-Q61L、Nras-Q61H1和Nras-Q61H2中的至少一种；优选含有Kras-G12D、Kras-Q61L和Nras-Q61K质粒。可选的，所述试剂盒所适用的样本选自组织样本，所述组织样本优选石蜡包埋切片。可选的，所述Ras基因MIX3反应液中含有Taq酶0.4～0.6体积份，UNG酶0.2～0.3体积份；优选的，所述Ras基因MIX3反应液中含有Taq酶0.46体积份，UNG酶0.23体积份；其中，UNG酶的活性单位为1U/μl，Taq酶的活性单位为5U/μl。本申请还涉及用于检测人Ras基因突变的引物和探针，包括用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针、用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人Ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5和Ras内参基因反应液；所述Ras基因反应液1用于检测Kras基因第2号外显子，所述Ras基因反应液3用于检测Kras基因第3号外显子，所述Ras基因反应液5用于检测Nras基因第3号外显子，所述Ras内参基因反应液用于检测内参基因：/n其中，所述Ras基因反应液1中包括由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的上游引物、由SEQ ID NO:13所示的下游引物、由SEQ ID NO:14所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；/n所述Ras基因反应液3中包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2～SEQ IDNO:9所示的下游引物、由SEQ ID NO:10所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；/n所述Ras基因反应液5中包括由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:17所示的上游引物、SEQ IDNO:18所示的下游引物、由SEQ ID NO:19所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；/n所述Ras内参基因反应液中包括由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ IDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:22所示的内参基因探针；/n所述探针的两端标记有荧光基团。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测人Ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5和Ras内参基因反应液；所述Ras基因反应液1用于检测Kras基因第2号外显子，所述Ras基因反应液3用于检测Kras基因第3号外显子，所述Ras基因反应液5用于检测Nras基因第3号外显子，所述Ras内参基因反应液用于检测内参基因：
其中，所述Ras基因反应液1中包括由SEQIDNO:11、SEQIDNO:12所示的上游引物、由SEQIDNO:13所示的下游引物、由SEQIDNO:14所示的探针、由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:23所示的内控探针；
所述Ras基因反应液3中包括由SEQIDNO:1所示的上游引物、由SEQIDNO:2～SEQIDNO:9所示的下游引物、由SEQIDNO:10所示的探针、由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:23所示的内控探针；
所述Ras基因反应液5中包括由SEQIDNO:15～SEQIDNO:17所示的上游引物、SEQIDNO:18所示的下游引物、由SEQIDNO:19所示的探针、由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:23所示的内控探针；
所述Ras内参基因反应液中包括由SEQIDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQIDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQIDNO:22所示的内参基因探针；
所述探针的两端标记有荧光基团。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQIDNO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQIDNO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括Ras基因MIX3反应液，所述Ras基因MIX3反应液中含有Taq酶、UNG酶和dNTPs。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有Ras基因突变质粒以及内参质粒，所述Ras基因突变质粒选自Kras-G12A、Kras-G12R、Kras-G12D、Kras-G12C、Kras-G12S、Kras-G12V、Kras-G13C、Kras-G13D、Kras-Q61R、Kras-Q61L、Kras-Q61H1、Kras-Q61H2、Nras-Q61K、Nras-Q61R、Nras-Q61L、Nras-Q61H1和Nras-Q61H2中的至少一种；优选含有Kras-G12D、Kras-Q61L和Nras-Q61K质粒。

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，谢立群，徐任，陆孟超，童光铨，李云航，高峰英，
申请(专利权)人：苏州云泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32