一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用，属于鱼类骨骼染色技术领域；所述染色方法包括以下步骤：1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃后，置于多聚甲醛溶液中进行固定；2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明获得肌肉透明样本；4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色获得整体均被染色的样本；5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色获得肌间刺染色的样本。所述方法能够实现对滇池金线鲃肌间刺进行快速染色，达到清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等预期效果的要求。

A staining method and its application for sarcophagus of Spinibarbus auratus in Dianchi Lake

The invention provides a dyeing method and its application for the intramuscular spines of Spinibarbus auratus in Dianchi Lake, belonging to the technical field of fish bone dyeing; the dyeing method comprises the following steps: 1) anaesthetize Spinibarbus auratus in Dianchi Lake with anaesthetic liquid, place it in the polyformaldehyde solution for fixation; 2) wash the fixed sample, place it in the bleach solution to remove the body surface pigment, and obtain the sample for removing the body surface pigment This; 3) put the depigmentation sample in the enzyme digestion solution and digest it to the head muscle of the sample to obtain the muscle transparent sample; 4) put the muscle transparent sample in the staining solution for intramuscular prick dyeing to obtain the samples dyed as a whole; 5) put the samples dyed as a whole in the dehydration decolorization solution for gradient dehydration decolorization to obtain the samples dyed as a whole. The method can be used to fast dye the intramuscular barbs of Spinibarbus auratus in Dianchi Lake, and achieve the requirements of clearly observing the number, shape and attachment position of the intramuscular barbs of Spinibarbus auratus in Dianchi Lake.

【技术实现步骤摘要】
一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用
本专利技术属于鱼类骨骼染色
，尤其涉及一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用。
技术介绍
滇池金线鲃Sinocyclocheilusgrahami(Regan,1904)，隶属于鲤形目(Cyprinidformes)鲤科(Cyprinidae)金线鲃属(Sinocyclocheilus)，地方俗称金线鱼、小洞鱼。该种为非典型洞穴生活鱼类，主要分布于滇池及其附属水域的河流、龙潭中，为滇池特有种。因肉质细嫩，味道鲜美，而被列为云南四大名鱼之一。目前，有关滇池金线鲃的研究多集中在亲鱼培育、繁殖力、胚胎的存活率、抗病性、肌肉的营养成分、杂交后代优势、光周期变化带来的影响及基因组学等多个方面，涉及其肌间刺的研究很少，其中，涉及其肌间刺染色的研究还未发现。肌间刺，也称肌间骨，是指位于肌隔中的膜性硬骨，由肌间结缔组织不经过软骨阶段直接骨化而成，仅存在于真骨鱼类，按附着位置分为3类，分别为髓弓小骨，脉弓小骨和椎体小骨。目前，有关鱼类骨骼的研究方法主要有传统的解剖学方法，骨骼染色法以及射线照射法。相较解剖法与射线法，骨骼染色法具有结果形象直观，能清晰的观察骨骼结构及其位置，实施过程成本低，无需复杂仪器设备。此外，骨骼染色法还具有其他研究方法所不具有的优势，能够应用于较小样本骨骼的研究。目前对于滇池金线鲃肌间刺的染色上没有一种成熟有效的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法及其应用，所述方法能够实现对滇池金线鲃肌间刺进行快速染色，达到清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等预期效果的要求。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃，然后将麻醉后的滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本；2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明，获得肌肉透明样本；4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色，获得整体均被染色的样本；5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色，获得肌间刺染色的样本。优选的，所述酶消化液中包括胰蛋白酶和蛋白酶K。优选的，所述酶消化液还包括饱和硼酸钠溶液和去离子水；所述硼酸钠溶液、去离子水、胰蛋白酶和蛋白酶K的比例为(25～35)ml：(60～80)ml：1g：(0.1～0.2)g。优选的，步骤1)中所述多聚甲醛溶液的质量浓度为1.5～2.5％，所述固定的时间为7～15d。优选的，步骤2)中所述固定样本清洗包括依次进行的第一水洗、TBST溶液深度清洗和第二水洗。优选的，步骤2)中的所述漂白剂溶液包括质量浓度为0.4～0.6％的KOH溶液和质量浓度为2.5～3.5％的H2O2；所述KOH溶液与H2O2的体积比为(2.5～3.5):1。优选的，在所述去除体表色素的过程中，使用LED灯照射样本，所述LED灯的照射时间为2～4h，所述LED灯的灯管光通量为15～25W。优选的，步骤4)中所述的染色液为4.5～5.5g/L的茜素红的乙醇溶液，所述茜素红的乙醇溶液中的溶剂乙醇为质量分数≥99.7％。优选的，步骤4)中所述肌间刺染色的时间为12～36h；所述肌间刺染色的温度为20～30℃，所述肌间刺染色的过程中避光。优选的，步骤5)中所述梯度脱水脱色包括依次进行的一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色；所述脱水脱色液中包括质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的脱水脱色液中质量浓度0.5％的KOH溶液、去离子水和甘油的体积比分别为(1.8～2.2):(1.8～2.2):1；(1.8～2.2):1:(1.8～2.2)，1:1:(2.8～3.2)；所述一级脱水脱色、二级脱水脱色和三级脱水脱色的次数分别为2～4次、1～3次和1～3次；每一次脱水脱色的时间为15～25min。本专利技术还提供了所述的染色方法在滇池金线鲃肌间刺形态结构研究中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的滇池金线鲃肌间刺的染色方法，通过麻醉、固定、去除体表色素、酶消化液消化、染色和脱水脱色的步骤，能够实现对滇池金线鲃肌间刺进行快速染色，达到清晰的观察滇池金线鲃肌间刺的数量、形态，附着位置等预期效果的要求；本专利技术将染色液的脱色步骤与样本脱水步骤合并，简化了染色步骤，缩短了染色时间。进一步的，本专利技术所述方法在酶消化液中加入的蛋白酶K不仅能有效缩短肌肉组织的透明时间，同时也避免了因消化时间长而导致的肌间刺与肌肉散离情况。更进一步的，本专利技术所述方法在染色阶段，使用质量分数≥99.7％的乙醇配制的茜素红的染色液液质透光度较好，能实时观察到滇池金线鲃肌间刺的染色效果。附图说明图1为实施例中滇池金线鲃稚鱼肌间刺的染色方法流程图；图2为滇池金线鲃稚鱼肌间刺染色效果图，其中A为脉弓小骨，B为髓弓小骨，C为脊椎骨。具体实施方式本专利技术提供了一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃后，置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本；2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明获得肌肉透明样本；4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色获得整体均被染色的样本；5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色获得肌间刺染色的样本。本专利技术用麻醉液麻醉滇池金线鲃后，置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本。在本专利技术中，所述滇池金线鲃优选的为滇池金线鲃稚鱼；本专利技术中所述麻醉液优选为MS-222溶液，所述MS-222溶液的浓度优选为0.005～0.015g/L，更优选为0.01g/L；所述麻醉液优选的现配现用，本专利技术中所述麻醉液的用量以鱼体体长与麻醉液的比例计，优选为1cm:(8～12)ml，更优选为1cm:10ml。本专利技术中所述麻醉的时间优选为3～5min，更优选为4min。本专利技术在固定样本前选用MS-222进行麻醉，确保了固定后的鱼体姿态规整，提高了整体染色效果。本专利技术中，所述麻醉后优选的还包括漂洗步骤，所述漂洗优选的用去离子水进行，本专利技术对所述漂洗的方法和时间没有特殊限定，采用本领域常规方法和时间即可。本专利技术在所述漂洗后将滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中进行固定，获得固定样本。本专利技术中所述多聚甲醛溶液的质量浓度优选为1.5～2.5％，更优选为1.8～2.2％，最优选为2.0％；本专利技术中所述固定的时间优选为7～15d，更优选为8～14d。本专利技术中，所述固定用的容器优选为塑料材料管。本专利技术在获得所述固定样本后，将所述固定样本清洗。在本专利技术中，所述固定样本清洗包括依次进行的第一水洗、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：/n1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃，然后将麻醉后的滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中固定，获得固定样本；/n2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；/n3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明，获得肌肉透明样本；/n4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色，获得整体均被染色的样本；/n5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色，获得肌间刺染色的样本。/n

【技术特征摘要】
1.一种滇池金线鲃肌间刺的染色方法，包括以下步骤：
1)用麻醉液麻醉滇池金线鲃，然后将麻醉后的滇池金线鲃置于多聚甲醛溶液中固定，获得固定样本；
2)将所述固定样本清洗后，置于漂白剂溶液中去除体表色素，获得去除体表色素的样本；
3)将所述去除体表色素样本置于酶消化液中消化至样本头部肌肉透明，获得肌肉透明样本；
4)将所述肌肉透明样本置于染色液中进行肌间刺染色，获得整体均被染色的样本；
5)将所述整体均被染色的样本置于脱水脱色液中进行梯度脱水脱色，获得肌间刺染色的样本。


2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述酶消化液中包括胰蛋白酶和蛋白酶K。


3.根据权利要求2所述的染色方法，其特征在于，所述酶消化液还包括饱和硼酸钠溶液和去离子水；所述硼酸钠溶液、去离子水、胰蛋白酶和蛋白酶K的比例为(25～35)ml：(60～80)ml：1g：(0.1～0.2)g。


4.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤1)中所述多聚甲醛溶液的质量浓度为1.5～2.5％，所述固定的时间为7～15d。


5.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤2)中所述固定样本清洗包括依次进行的第一水洗、TBST溶液深度清洗和第二水洗。


6.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤2)中的所述漂白剂溶液包括质量浓度为0.4～0.6％的KOH溶液和质量浓度为2.5～3.5％的H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨坤凤，王晓爱，张源伟，潘晓赋，杨君兴，范伟，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53