The invention provides a composition and a method for rapidly producing chemicals on a large scale in a genetically engineered microorganism. It also provides a high-throughput metabolic engineering platform that can quickly optimize microbial production strains. The platform bridges the gap between the current in vivo and in vitro biological production methods, and relies on the dynamic minimization of the active metabolic network.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于稳健动态代谢控制的组合物和方法交叉引用本申请要求于2017年2月21日提交的申请号为62/461,436的美国临时申请的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术是在政府支持下完成的，联邦资助号为HR0011-14-C-0075，12043956和1445726，由DOD/DARPA、NAVY/ONR和NSF分别授予。政府对本专利技术享有一定的权利。序列表的引用本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝是在2018年2月21日创建的，命名为52240_702_601_SL.txt，大小为81，697字节。
技术介绍
已经成功开发了基于生物技术的发酵工艺以生产各种物质，从生物制剂和小分子疗法到特种、大宗和商业化学品，甚至下一代生物燃料。近年来，由于发酵科学和合成生物学以及代谢和酶工程领域的技术发展，这些工艺取得了快速进展。尽管取得了这些重大进展，但合理和定向工程方法的大多数成功示例也极大地依赖于许多且通常很长的试错循环。本公开提供了一种策略，其同时降低了问题的复杂性(以及相关设计空间的大小)，同时还最小化了对环境条件的代谢响应，增加了工程株的稳健性和可扩展性。
技术实现思路
本专利技术部分地提供了一种能够快速开发微生物生产菌株的高通量工程平台。一方面，本专利技术提供一种产生产物的细胞，其中所述细胞包括：异源多核苷酸，用于受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述...
【技术保护点】
1.一种产生产物的细胞，其中所述细胞包括：/n异源多核苷酸，用于受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期；和/n异源生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；/n其中，与缺乏所述酶的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期所述产物的产生速率被降低地更少。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170221 US 62/461,4361.一种产生产物的细胞，其中所述细胞包括：
异源多核苷酸，用于受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期；和
异源生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；
其中，与缺乏所述酶的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期所述产物的产生速率被降低地更少。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述异源多核苷酸通过所述代谢途径降低通量。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述酶选自下组：烯酰-ACP/CoA还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶、柠檬酸合酶、可溶性转氢酶和NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中所述生产酶选自下组：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶、丙氨酸输出物和NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞，其中所述环境条件的改变包括增加或降低接触所述细胞的培养基中糖的浓度。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述糖是葡萄糖。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞，其中所述环境条件的改变包括增加或降低接触所述细胞的培养基的氧合作用。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞，其中所述产物包含3-羟基丙酸。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞，其中所述产物包含氨基酸。
10.根据权利要求9所述的细胞，其中所述氨基酸包含丙氨酸。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物的所述丙氨酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.0g/L/小时。
13.根据权利要求11所述的细胞，其中所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.5g/L/小时。
14.根据权利要求11所述的细胞，其中所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.6g/L/小时。
15.根据权利要求10所述的细胞，其中所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物产生至少80g/L的所述丙氨酸。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述培养物产生至少100g/L的所述丙氨酸。
17.根据权利要求15所述的细胞，其中所述培养物产生至少120g/L的所述丙氨酸。
18.根据权利要求15所述的细胞，其中所述培养物产生至少140g/L的所述丙氨酸。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的细胞，其中所述生产多核苷酸编码丙氨酸输出物。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述丙氨酸输出物是alaE。
21.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞，其中所述产物包含甲羟戊酸。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物的所述甲羟戊酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中所述甲羟戊酸的所述产生速率为至少1.0g/L/小时。
24.根据权利要求22所述的细胞，其中所述甲羟戊酸的所述产生速率为至少1.2g/L/小时。
25.根据权利要求22所述的细胞，其中所述甲羟戊酸的所述产生速率至少为1.25g/L/小时。
26.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物产生至少50g/L的所述甲羟戊酸。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述培养物产生至少70g/L的所述甲羟戊酸。
28.根据权利要求26所述的细胞，其中所述培养物产生至少90g/L的所述甲羟戊酸。
29.根据权利要求26所述的细胞，其中所述培养物产生至少95g/L的所述甲羟戊酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的细胞，其中所述异源多核苷酸选自下组：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述酶的基因的转录；和降解多核苷酸，用于介导所述酶的细胞降解。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述异源多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述酶的基因的启动子的gRNA序列。
32.根据权利要求31所述的细胞，其中所述异源多核苷酸编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中所述CRISPR酶是催化失活的。
34.根据权利要求30所述的细胞，其中所述异源多核苷酸包含降解多核苷酸，其中所述降解多核苷酸包含编码降解标签的序列，其中所述降解标签介导所述酶的降解。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的细胞，其中所述异源多核苷酸的表达受所述细胞中的磷酸盐可用性的调节。
36.根据权利要求1至34中任一项所述的细胞，其中所述生产多核苷酸的表达受所述细胞中的磷酸盐可用性的调节。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。
38.一种方法，包括：
独立培养多个细胞株，其中每个细胞株包含(i)异源多核苷酸，用于介导受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期；以及(ii)异源生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；其中所述多个细胞株中的每个细胞株均与另一个细胞株不同，不同之处在于所述异源多核苷酸或所述异源生产多核苷酸两者中至少一者的序列；
使所述多个细胞株生长到稳定期；以及
选择所述多个细胞株中的一个细胞株，基于在所述稳定期由所述选择的细胞株产生的所述产物的水平来选择。
39.根据权利要求38所述的方法，还包括确定所述产物的所述水平。
40.根据权利要求38所述的方法，还包括培养所述选择的细胞株。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述选择的细胞株在生物反应器中生长。
42.根据权利要求41所述的方法，其中包含所述选择的细胞株的培养基的体积为...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·大卫·林奇，叶志夏，
申请(专利权)人：杜克大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。