一种牛奶中总微生物DNA的提取方法技术

为解决现有技术中提取牛奶总微生物DNA过程中提取不全面，蛋白脂肪杂质多以及DNA浓度低等问题。本发明专利技术提供了一种快速、高效，可用于直接PCR扩增的牛奶微生物DNA提取方法，采用TE溶液处理牛奶、采用珠磨充分破坏微生物细胞、使用高真空硅脂在水相与有机相的中间层固定蛋白质，防止中间层杂质进入水相等，所提取的DNA质量完整、浓度及纯度高。

A method of extracting total microbial DNA from milk

In order to solve the problems of incomplete extraction, more protein and fat impurities and low DNA concentration in the process of extracting the total microbial DNA of milk in the prior art. The invention provides a fast and efficient method for extracting microbial DNA from milk, which can be used for direct PCR amplification. Milk is treated with te solution, microbial cells are fully destroyed with bead mill, proteins are fixed in the middle layer of water phase and organic phase with high vacuum silicone grease, so as to prevent the impurities in the middle layer from entering the water, and the extracted DNA has complete quality, high concentration and purity.

【技术实现步骤摘要】
一种牛奶中总微生物DNA的提取方法
本专利技术属于食品质量安全
，具体涉及牛奶中总微生物基因组DNA的提取方法，以及在以该DNA为模板进行PCR扩增后，对牛奶中的微生物种类进行鉴定。
技术介绍
牛奶是乳及乳制品加工的原料，是质量安全的源头，对下游加工产品的安全和质量有直接影响。牛奶中是否含有微生物以及所含微生物的种类和数量是评价牛奶质量的一个重要指标，由于大部分的微生物不能通过培养的方式被鉴定出来，因此通过纯培养的方式不能鉴定到牛奶中可能含有的全部微生物种类。目前，利用PCR扩增鉴定微生物种类，可以有效鉴定到大量未培养微生物，但该方法需要提取得到的微生物DNA的量和纯度不能太低，因此对于该方法而言，微生物DNA的提取是首要关键的步骤。目前，已有的提取牛奶微生物DNA的方法，普遍操作步骤繁琐、成本高、一般只能提取牛奶中一种或几种微生物的DNA，而且由于牛奶蛋白去除不完全、细胞破碎效率差、残留杂质多等问题，导致提取得到的牛奶微生物DNA浓度很低且纯度不高，导致结果容易出现假阴性。因此需要寻找一种操作步骤简单，且快速、高效的牛奶中总微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛奶中总微生物DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)牛奶前处理：取牛奶样品置于离心管中，离心，弃上清，去除脂肪，加入TE溶液，用移液枪反复吹打，直至沉淀充分溶解，离心，弃上清，去除残留脂肪，保留沉淀；/n(2)微生物裂解：在步骤(1)得到的沉淀中加入CTAB裂解液，用移液枪反复吹打，直至沉淀完全溶解，加入玻璃珠，在珠磨仪上进行细胞破碎，加入蛋白酶K溶液，水浴，离心，取上清液；/n(3)DNA纯化：在步骤(2)得到的上清液中加入等体积酚:氯仿:异戊醇混合溶液，旋涡混合直至得到白色乳状物，加入适量高真空硅脂，离心，取上层水相，加入冷的异丙醇，颠倒混匀，静置，离心，弃上清，加...

【技术特征摘要】
1.一种牛奶中总微生物DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)牛奶前处理：取牛奶样品置于离心管中，离心，弃上清，去除脂肪，加入TE溶液，用移液枪反复吹打，直至沉淀充分溶解，离心，弃上清，去除残留脂肪，保留沉淀；
(2)微生物裂解：在步骤(1)得到的沉淀中加入CTAB裂解液，用移液枪反复吹打，直至沉淀完全溶解，加入玻璃珠，在珠磨仪上进行细胞破碎，加入蛋白酶K溶液，水浴，离心，取上清液；
(3)DNA纯化：在步骤(2)得到的上清液中加入等体积酚:氯仿:异戊醇混合溶液，旋涡混合直至得到白色乳状物，加入适量高真空硅脂，离心，取上层水相，加入冷的异丙醇，颠倒混匀，静置，离心，弃上清，加入乙醇水溶液洗涤沉淀，离心，弃上清，将沉淀置于滤纸上，室温下干燥得牛奶总微生物DNA。


2.一种牛奶中微生物种类的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)牛奶前处理：取牛奶样品置于离心管中，离心，弃上清，去除脂肪，加入TE溶液，用移液枪反复吹打，直至沉淀充分溶解，离心，弃上清，去除残留脂肪，保留沉淀；
(2)微生物裂解：在步骤(1)得到的沉淀中加入CTAB裂解液，用移液枪反复吹打，直至沉淀完全溶解，加入玻璃珠，在珠磨仪上进行细胞破碎，加入蛋白酶K溶液，水浴，离心，取上清液；
(3)DNA纯化：在步骤(2)得到的上清液中加入等体积酚:氯仿:异戊醇混合溶液，旋涡混合直至得到白色乳状物，加入适量高真空硅脂，离心，取上层水相，加入冷的异丙醇，颠倒混匀，静置，离心，弃上清，加入乙醇水溶液洗涤沉淀，离心，弃上清，将沉淀置于滤纸上，室温下干燥得牛奶总微生物DNA；
(4)微生物种类鉴定：将步骤(3)得到的牛奶总微生物DNA用TE溶液溶解，进行PCR扩增，用PCR产物纯化试剂盒进行回收和纯化，测序，继而鉴定牛奶中的微生物种类。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，牛奶样品的量优选1-10ml，最优选7ml。
加入TE溶液之前和之后的离心均优选12000-15000g，最优选14000g，离心时间优选3-10min，最优选5min。
优选用灭菌棉签去除脂肪和残留脂肪。
TE溶液的加入量优选1-5ml，最优选3ml。
TE溶液的浓度优选1-20mMTris–HCl，0.5-5mMEDTA或EDTA二钠，pH值为7-9，最优选10mMTris–HCl，1mMEDTA或EDTA二钠，pH值为8。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，CTAB裂解液的体积优选500-1500μl，最优选1000μl。
玻...

【专利技术属性】
技术研发人员：王加启，赵圣国，郑楠，周旭，李松励，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11