一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法技术

本发明专利技术公开了一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法；检测引物采用LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP。本发明专利技术的有益效果为：采用本发明专利技术的检测方法、引物及验证方法进行检测，5个不同地理来源的枸杞根腐病尖孢镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色，即阳性，而对照和其他病原菌均呈橘色，即阴性。本专利具有引物特异性强、检测灵敏度高、反应速度快、直接用肉眼观察结果、准确性高、不易污染、对疑似病害样本直接检测等优点。同时通过显色进行比对判断，大幅提升检测准确性。

A method of loop mediated isothermal amplification for detection of Fusarium oxysporum root rot of Lycium barbarum

The invention discloses a ring mediated isothermal amplification detection method for detecting Fusarium oxysporum of wolfberry root rot, a detection primer and a verification method thereof; the detection primer is designed by lamp design software primer software primer Explorer V4, including two outer primers F3 and B3, two inner primers FIP and BiP. The beneficial effect of the invention is that: the detection method, primer and verification method of the invention are used for detection, the lamp detection of five different geographical sources of wolfberry root rot Fusarium oxysporum is yellow green, i.e. positive, while the control and other pathogenic bacteria are orange, i.e. negative. The patent has the advantages of strong primer specificity, high detection sensitivity, fast reaction speed, direct visual observation results, high accuracy, not easy to pollute, direct detection of suspected disease samples, etc. At the same time, the accuracy of detection is greatly improved by color comparison.

【技术实现步骤摘要】
一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法
本专利技术涉及植物病害病原菌检测
，具体涉及一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法。
技术介绍
枸杞根腐病发病症状：发病初期，病株叶片灰绿，中午萎蔫，早晚可恢复。其后不再恢复，叶片变枯黄，缓慢死亡。根茎部稍肿胀，韧皮部变红褐色，发软，外部有白色菌丝，木质部有红褐色细条纹，有时渗入深层。主根及侧根的韧皮部变软发褐死亡。表皮纵裂，韧皮部中有很多白色粉质小点，易自木质部上剥落。现有研究发现枸杞根腐病的主要病原菌为尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)，在PDA培养基上菌落白色、粉色至紫色。7d后菌落直径90mm，隆起呈羊毛状，菌背产生粉色或紫色色素。菌丝无色，有隔。产孢梗单瓶梗，大小为8.2～16.5μm×1.8μm(平均11.8μm×1.8μm)。大型分生孢子镰孢形，中间粗，两端尖细，具3～5个横膈膜，多为3个隔，大小为23.5～32.9μm×2.4～3.5μm(平均27.5μm×2.7μm)，足胞明显。小型分生孢子椭圆形、长椭圆形，单胞，无色，假头状，大小为3.5～14.1μm×1.8～2.9μm(平均6.8μm×2.5μm)。厚垣孢子很多，单生、对生、间生或顶生，球形，大小为5.5～10.0μm。上述培养方法虽然可以进行尖孢镰孢菌检测，但是需要工作人员实时观测形状变化情况并进行记录才能进行判定。上述方法培养周期长、判定标准不一。尤其无法适用田间快速测试，培养周期过长检测结果确定后田间已发生大面积灾害，无法提前防控。LAMP检测具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点，广泛应用于真菌、细菌、病毒、线虫等病原微生物的检测。LAMP反应的原理，利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环，扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点.以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。LAMP反应的特点是，(1)灵敏度高：LAMP的检测灵敏度通常比PCR高10～1000倍，与real-timePCR灵敏度相近。(2)高特异性：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。(3)快速高效：不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成的时间损失.核酸扩增在lh内均可完成，比PCR反应更快完成。在LAMP扩增体系中增加1条环引物可加速扩增反应，缩短反应时间，使扩增反应能在30min内完成，提高了LAMP检测的效率。(4)产物检测直观：LAMP扩增产生大量的双链DNA，向反应管中加入焚光染料SYBRGreenI，根据颜色变化判断扩增是否发生。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测的检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法。枸杞根腐病尖孢镰孢菌的基因序列：TTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGTTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGAGGAACGCGAATTAACGCGAGTCCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAAGTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATG具体如序列表中序列1所示。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测用引物，所述环介导等温扩增检测引物为：F3：5’-GTCCGAAAATTTTGCGGTGC-3’；B3：5’-TTCCAGTGGTTAGTGACTGC-3’；FIP：5’-AGTGGCGGGGTAAGATACCCC-3’；BIP：5’-GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC-3’。本专利技术的第二个目的是提供了一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，使用上述的环介导等温扩增检测引物进行环介导等温扩增。进一步的，上述的一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：A、病样采集：采集枸杞根腐病病株，室内以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；B、菌株培养：病原菌培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、自来水1000mL，光照条件下室温25℃进行培养；C、菌株基因组DNA提取：采用E.Z.N.ATMHPFungalDNAKit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600μL的CPL缓冲液，加10μLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600μL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000r/min下离心处理5min；吸取上清液300μL至新的离心管中，加150μLCXD缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测用引物，其特征在于，所述环介导等温扩增检测引物为：/nF3：5’-GTCCGAAAATTTTGCGGTGC-3’；/nB3：5’-TTCCAGTGGTTA GTGACTGC-3’；/nFIP：5’-AGTGGCGGGGTAAGATACCCC-3’；/nBIP：5’-GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测用引物，其特征在于，所述环介导等温扩增检测引物为：
F3：5’-GTCCGAAAATTTTGCGGTGC-3’；
B3：5’-TTCCAGTGGTTAGTGACTGC-3’；
FIP：5’-AGTGGCGGGGTAAGATACCCC-3’；
BIP：5’-GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC-3’。


2.一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的环介导等温扩增检测引物进行环介导等温扩增。


3.根据权利要求2所述的一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、病样采集：
采集枸杞根腐病病株，室内以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；
B、菌株培养：
病原菌培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、自来水1000mL，光照条件下室温25℃进行培养；
C、菌株基因组DNA提取：
采用E.Z.N.ATMHPFungalDNAKit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600μL的CPL缓冲液，加10μLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600μL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000r/min下离心处理5min；
吸取上清液300μL至新的离心管中，加150μLCXD缓冲液，再加300μL无水乙醇制得上清混合液，将上述750μL上清混合液加到HiBindDNA柱中，转速12000r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液；
沉淀物中加入650μLSPW洗液，转速12000r/min下离心处理1min；再加入650μLSPW洗液，转速12000r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液，沉淀物放入新的离心管中转速12000r/min下离心处理1min；
将洗涤后的沉淀物转入新的离心管中，加入预热65℃的Elution缓冲液100μL，转速12000r/min下离心处理2min，最后转速12000r/min下离心处理1min溶解DNA制得DNA模板；
D、病原菌ITS序列的扩增及LAMP引物的设计：
对枸杞根腐病菌的溶解DNA中ITS序列进行扩增、克隆、测序，获得其病菌尖孢镰孢菌的ITS序列，采用LAMP设计软件primersoftwarePrimerExplorerV4进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；其序列分别为：
F3：5’-GTCCGAAAATTTTGCGGTGC-3’；
B3：5’-TTCCAGTGGTTAGTGACTGC-3’；
FIP：5’-AGTGGCGGGGTAAGATACCCC-3’；
BIP：5’-GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC-3’；
E、LAMP反应体系的建立：
在60～80℃范围内进行LAMP反应，反应时间20min-1h，LAMP反应体系为10×IsothermalAmplificationBuffe1～3μL、100mmol/LMgSO40.5～2μL、内引物FIP0....

【专利技术属性】
技术研发人员：漆永红，李敏权，李雪萍，曹素芳，李建宏，李继平，申培增，陈爱昌，
申请(专利权)人：甘肃省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62