一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法技术

本发明专利技术公开了一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色方法，具体过程为：用多聚甲醛固定黄河鲤稚鱼样品；用蒸馏水洗去PFA；用TBST浸泡稚鱼标本；用蒸馏水洗去残余的TBST；用KOH溶液透明黄河鲤稚鱼标本；更换新的KOH溶液，并滴加茜素红染色；倒掉染液，加入蒸馏水洗去浮色；将黄河鲤稚鱼转至双氧水的KOH溶液中，去除表面色素；用KOH溶液洗去残余的双氧水；将黄河鲤稚鱼转至甘油中梯度透明；在体式镜下拍照留存；将黄河鲤稚鱼转至100%甘油中保存。本发明专利技术使用最佳的试剂，通过对不同染色条件的探索，筛选出最优的染色条件，最终获得身体透明、肌间骨染色为红色或紫色的黄河鲤稚鱼优质标本，可用体式镜清楚的观察到肌间骨附着位置。

A method of staining the intermuscular bone of juvenile Yellow River carp

The invention discloses a method for staining the intermuscular bone of Yellow River carp juveniles, the specific process is: fixing the sample of Yellow River carp juveniles with polyformaldehyde; washing the PFA with distilled water; soaking the sample of Yellow River carp juveniles with tbst; washing the residual tbst with distilled water; making the sample of Yellow River carp juveniles transparent with KOH solution; replacing the new KOH solution and dripping alizarin red; pouring out the dye solution and adding distilled water to wash the floating color ; transfer the Yellow River carp juveniles to KOH solution of hydrogen peroxide to remove the surface pigment; wash the residual hydrogen peroxide with KOH solution; transfer the Yellow River carp juveniles to glycerin with gradient transparency; take photos under the body mirror for preservation; transfer the Yellow River carp juveniles to 100% glycerin for preservation. The invention uses the best reagent, through the exploration of different dyeing conditions, selects the best dyeing conditions, and finally obtains the high-quality specimen of Yellow River carp juveniles whose body is transparent and whose intermuscular bone is dyed red or purple. The attachment position of intermuscular bone can be clearly observed by the body mirror.

【技术实现步骤摘要】
一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法
本专利技术属于稚鱼肌间骨染色
，具体涉及一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，该方法在黄河鲤肌间骨骨化过程，及分子机制研究中具有重要用途，适用于染色后获得透明标本，可用体视镜清晰地观察到稚鱼肌间骨的附着位置。
技术介绍
黄河鲤（Cyprinuscarpio）隶属鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鲤属（Cyprinus）。黄河鲤是我国黄河长期自然形成的特有的重要淡水经济鱼类，具有适应性强、食性广、抗逆性强、外表美观、味道鲜美等优点。但由于肌间骨的存在，给黄河鲤的食用带来极大的不便，也限制了黄河鲤的养殖业的发展。黄河鲤稚鱼染色不仅促进了解肌间骨分布与骨化，还能为其肌间骨分子机制的研究和培育少肌间骨鱼类奠定基础。鱼类的肌间骨又称为肌间刺，是由肌间的间充质细胞不经过软骨阶段直接发育而来。依据肌间骨附着部位可将其分为三类：附着在髓弓上的髓弓小骨，附着在脉弓上的脉弓小骨以及附着在椎体上的椎体小骨。目前已经有团头鲂和黄鳝成鱼的染色技术，但是还没有针对黄河鲤稚鱼肌间骨染色方法。团头鲂成鱼体长一般在165-456mm之间，黄河鲤稚鱼的体长在9-15mm之间，体重在6-10mg之间，团头鲂成鱼骨骼鳞片和器官都已发育完全，黄河鲤稚鱼骨骼鳞片都处在发育过程中。稚鱼肌间骨较之成鱼纤细、钙化程度低，茜素红难以与肌间骨上的钙结合，肌间骨不易着色；稚鱼肌肉易着色，在肌肉褪色过程中，肌间骨也易随之褪色。故，在固定标本，去除体表鳞片和色素，肌间骨与茜素红染液的结合强度，去除内脏，肌肉透明和观察肌间骨等方面，成鱼肌间骨与稚鱼肌间骨染色都有较大区别。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种方法简单、易于操作且所用试剂廉价易于购买的黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，该方法易于获得身体透明，可用体视镜清晰观察到肌间骨位置的黄河鲤稚鱼标本，在黄河鲤稚鱼肌间骨骨化及其它鲤科鱼类稚鱼肌间骨骨化研究中具有重要意义。本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案，一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，其特征在于具体过程为：（1）对出膜后22-26天的小鱼进行取材，并用3wt%-5wt%的PFA固定24小时；（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；（3）再转移鱼体到TBST溶液中漂洗20-30分钟；（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的TBST；（5）转移鱼体到1wt%KOH溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大程度适当延长时间，直至头部透明；（6）转移鱼体到新的1wt%KOH溶液中，再加入茜素红染液进行染色，KOH溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，于19-31℃进行染色，染色时间8-12小时；（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗1-2次，直至蒸馏水没有明显颜色；（8）用1wt%KOH溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为1%-5%，在强光下照射，至鱼体表面出现大量气泡为止，脱去鱼体表面色素，此过程5-20分钟；（9）倒掉溶液，加入1wt%KOH溶液，洗去残余的双氧水；（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度透明，透明0-30分钟；（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；（12）在100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。进一步优选，所述黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，其特征在于具体步骤为：（1）对出膜后24天的小鱼进行取材，并用4wt%PFA固定24小时；（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；（3）再转移鱼体到TBST溶液中漂洗30分钟；（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的TBST；（5）转移鱼体到1wt%KOH溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大程度适当延长时间，直至头部透明；（6）转移鱼体到新的1wt%KOH溶液中，再加入茜素红染液进行染色，KOH溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，25℃常温染色，染色时间10小时；（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗1-2次，直至蒸馏水没有明显颜色；（8）用1wt%KOH溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为3%，在强光下照射，至鱼体表明出现大量气泡为止，褪去鱼体表面色素，此过程10分钟；（9）倒掉溶液，加入1wt%KOH溶液，洗去残余的双氧水；（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度透明，透明30分钟，可根据颜色深浅在体积分数50%的甘油水溶液中延长透明时间；（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；（12）在体积分数100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。本专利技术具有以下优点和有益效果：本专利技术使用最佳的试剂，通过对不同染色条件的探索，筛选出最优的染色条件，最终获得身体透明、肌间骨染色为红色或紫色的黄河鲤稚鱼优质标本，可用体式镜清楚的观察到肌间骨附着位置，不仅为稚鱼肌间骨形态学研究提供方便，也可用于科普及作为艺术品。附图说明图1是黄河鲤稚鱼肌间骨染色整体示意图；图2是黄河鲤稚鱼尾部肌间骨示意图，可以清楚地看到髓弓小骨和脉弓小骨；图3是黄河鲤稚鱼尾部脉弓小骨的示意图；图4为黄河鲤稚鱼头部髓弓小骨的示意图；图5-7是未用双氧水褪色的示意图；图8-10是染色6小时示意图，稚鱼肌间骨明显未着色；图11-12是染色8小时示意图，稚鱼肌间骨染色不清晰且头部未着色；图13-16分别是19℃、25℃、31℃和37℃染色效果图；图17-20分别是1wt%、3wt%、5wt%和7wt%的双氧水不同褪色时间图；图21是甘油不同透明时间图。具体实施方式下面将结合本专利技术中的附图，对本专利技术具体实施过程中的技术方案进行清楚、完整、具体的描述。实施例1肌间骨染色原理是茜素红的羟基蒽醌结构和钙离子发生螯合反应，产生一种带色化合物，这样成骨细胞诱导的外层的钙结节就染成了深红色。对于一种化学反应，除反应物和底物以外，对其影响最大的便是反应温度和反应时间。因此本实施例分别对温度和染色时间对黄河鲤稚鱼肌间骨染色效果的影响进行了分析评估，并选择了最佳的染色温度和染色时间。通过对6、8、10小时不同染色时间和19℃、25℃、31℃、37℃不同染色温度的效果图进行分析，探索出能够获得最佳染色品质的方法。6小时、8小时、10小时不同染色时间，染色效果对比：（1）取材固定，对稚鱼取材，并用4wt%PFA固定24小时，其中PFA是将3-5g的多聚甲醛溶于PBS中，pH调至7.2；（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；（3）再转移鱼体到TBST溶液中漂洗30分钟；（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的TBST；（5）转移鱼体到1wt%KOH溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大适当延长时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，其特征在于具体过程为：/n（1）对出膜后22-26天的小鱼进行取材，并用3wt%-5wt%的PFA固定24小时，其中PFA是将3-5g的多聚甲醛溶于PBS中，pH调至7.2；/n（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；/n（3）再转移鱼体到TBST溶液中漂洗20-30分钟；/n（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的TBST；/n（5）转移鱼体到1wt% KOH溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大程度适当延长时间，直至头部透明；/n（6）转移鱼体到新的1wt% KOH溶液中，再加入茜素红染液进行染色，KOH溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，于19-31℃进行染色，染色时间8-12小时；/n（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗1-2次，直至蒸馏水没有明显颜色；/n（8）用1wt% KOH溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为1%-5%，在强光下照射，至鱼体表面出现大量气泡为止，脱去鱼体表面色素，此过程5-20分钟；/n（9）倒掉溶液，加入1wt% KOH溶液，洗去残余的双氧水；/n（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度透明，透明0-30分钟；/n（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；/n（12）在100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。/n...

【技术特征摘要】
1.一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，其特征在于具体过程为：
（1）对出膜后22-26天的小鱼进行取材，并用3wt%-5wt%的PFA固定24小时，其中PFA是将3-5g的多聚甲醛溶于PBS中，pH调至7.2；
（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；
（3）再转移鱼体到TBST溶液中漂洗20-30分钟；
（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的TBST；
（5）转移鱼体到1wt%KOH溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大程度适当延长时间，直至头部透明；
（6）转移鱼体到新的1wt%KOH溶液中，再加入茜素红染液进行染色，KOH溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，于19-31℃进行染色，染色时间8-12小时；
（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗1-2次，直至蒸馏水没有明显颜色；
（8）用1wt%KOH溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为1%-5%，在强光下照射，至鱼体表面出现大量气泡为止，脱去鱼体表面色素，此过程5-20分钟；
（9）倒掉溶液，加入1wt%KOH溶液，洗去残余的双氧水；
（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度透明，透明0-30分钟；
（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；
（12）在100%甘油中保存黄河鲤稚...

【专利技术属性】
技术研发人员：董传举，段晓迪，马晓，王磊，李学军，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41