长裂苦苣菜生物碱四级分离物及其分离方法和应用技术

本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及长裂苦苣菜生物碱四级分离物及其分离方法和应用。本发明专利技术通过超声方法提取长裂苦苣菜提取其中的生物碱成分，并利用制备色谱分离得到具有抗氧化能力的四级分离物，对长裂苦苣菜中生物碱类化合物的开发利用具有重要的现实意义。

The fourth grade alkaloid isolated from long split chicory and its separation method and Application

The invention belongs to the field of agricultural biotechnology, in particular to a four-stage alkaloid isolate of long split chicory and its separation method and application. The invention extracts the alkaloid components from the long split bitter endive by the ultrasonic method, and obtains a four-stage separation with antioxidant capacity by the preparation chromatography, which has important practical significance for the development and utilization of the alkaloid compounds in the long split bitter endive.

【技术实现步骤摘要】
长裂苦苣菜生物碱四级分离物及其分离方法和应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及长裂苦苣菜生物碱四级分离物及其分离方法和应用。
技术介绍
长裂苦苣菜(SonchusbrachyotusDC.)系菊科苦苣菜属一年生草本植物，又名苦菜、苦曲菜、苦曲曲、苦苣菜、苣荬菜、苦荬菜等。长裂苦苣菜药用历史悠久，据我国最早的医学专著《神农本草经》和李时珍的《本草纲目》记载，其味苦性寒，有清热解毒，消肿排脓，凉血化瘀，清肺止咳，益肝利尿，消食和胃之功效，用以治疗急性痢疾、肠炎、痔疮肿痛等症。长裂苦苣菜中的化学成分有β-谷甾醇，木犀草素，芹菜素和槲皮素，还有一些挥发油成分，研究表明，长裂苦苣菜具有抗菌、将血压、降胆固醇、抗肿瘤、治疗肝炎和抗氧化等多方面作用。但迄今为止，长裂苦苣菜中有效的抗氧化活性成分尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种长裂苦苣菜生物碱四级分离物。本专利技术的再一目的在于提供上述四级分离物的分离方法。本专利技术的再一目的在于提供上述四级分离物的应用。根据本专利技术具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，其由包括以下步骤的方法制备得到：(1)制备长裂苦苣菜提取物；(2)将步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物配制成100mg/mL的供试液，采用制备色谱法进行分离，色谱条件如下：采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；收集峰高范围在420-2000mAU的馏分，得到初级分离物；(3)将步骤(2)得到的初级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；收集峰高范围在0.2-1.8AU的馏分，得到次级分离物；(4)将步骤(3)得到的次级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速1mL/min，柱温30℃，波长为260nm，梯度洗脱程序为：在0-8min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为75％，流动相B的体积由5％变为25％；在8-10min的时间范围内，流动相A的体积由75％变为65％，流动相B的体积由25％变为35％；在10-20min的时间范围内，流动相A的体积由65％变为40％，流动相B的体积由35％变为60％；在20-24min的时间范围内，流动相A的体积由40％变为20％，流动相B的体积有60％变为80％；在24-27min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％，收集16-18min的馏分，得到三级分离物；(5)用HPLC法分离步骤(4)得到的三级分离物，色谱条件如下：以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，柱温30℃，波长260nm，梯度洗脱程序为：在0-10min时间范围内，流动相B的体积由5％变为95％，流动相A的体积由95％变为5％，收集5.8-6.2min的馏分，得到四级分离物。在反相色谱柱中，长裂苦苣菜生物碱提取物流出色谱柱的顺序是极性较强的组分先于极性弱的组分被洗脱出来，也就是说长裂苦苣菜生物碱提取物流出色谱柱的顺序受流动相极性的影响。同时，不同的流动相组成、梯度程序、流速、柱温等都会导致流动相的极性发生变化，进而导致馏分中有效成分的组成不同。本专利技术采用C18色谱柱分离生物碱，可在高pH条件下分离得到峰形良好、不拖尾的色谱峰，不但具有极高的载样量，而且可以保持高界面动力学系数，获得较好的柱效。根据本专利技术具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，步骤(2)中，柱温为30℃，波长为260nm。根据本专利技术具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，长裂苦苣菜提取物由包括以下步骤的方法制备得到：以75％乙醇为溶剂，将长裂苦苣菜制成液料比为30mL/g的提取溶液，进行超声提取，超声提取后，静置，取上清液即得。根据本专利技术具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，超声提取的功率为700W，温度为55℃，超声时间为30min。根据本专利技术具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱四级分离物的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：(1)制备长裂苦苣菜提取物；(2)将步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物配制成100mg/mL的供试液，采用制备色谱法进行分离，色谱条件如下：采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；收集峰高范围在420-2000mAU的馏分，得到初级分离物；(3)将步骤(2)得到的初级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.长裂苦苣菜生物碱四级分离物，其特征在于，所述四级分离物由包括以下步骤的方法制备得到：/n(1)制备长裂苦苣菜提取物；/n(2)将步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物配制成100mg/mL的供试液，采用制备色谱法进行分离，色谱条件如下：/n采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：/n在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；/n在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；/n在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；/n在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；/n收集峰高范围在420-2000mAU的馏分，得到初级分离物；/n(3)将步骤(2)得到的初级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：/n采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：/n在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；/n在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；/n在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；/n在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；/n收集峰高范围在0.2-1.8AU的馏分，得到次级分离物；/n(4)将步骤(3)得到的次级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：/n采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速1mL/min，柱温30℃，波长为260nm，梯度洗脱程序为：/n在0-8min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为75％，流动相B的体积由5％变为25％；/n在8-10min的时间范围内，流动相A的体积由75％变为65％，流动相B的体积由25％变为35％；/n在10-20min的时间范围内，流动相A的体积由65％变为40％，流动相B的体积由35％变为60％；/n在20-24min的时间范围内，流动相A的体积由40％变为20％，流动相B的体积有60％变为80％；/n在24-27min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％，收集16-18min的馏分，得到三级分离物；/n(5)用HPLC法分离步骤(4)得到的三级分离物，色谱条件如下：/n以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，柱温30℃，波长260nm，梯度洗脱程序为：/n在0-10min时间范围内，流动相B的体积由5％变为95％，流动相A的体积由95％变为5％，收集5.8-6.2min的馏分，得到四级分离物。/n...

【技术特征摘要】
20190613 CN 20191051032421.长裂苦苣菜生物碱四级分离物，其特征在于，所述四级分离物由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)制备长裂苦苣菜提取物；
(2)将步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物配制成100mg/mL的供试液，采用制备色谱法进行分离，色谱条件如下：
采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：
在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；
在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；
在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；
在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；
收集峰高范围在420-2000mAU的馏分，得到初级分离物；
(3)将步骤(2)得到的初级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：
采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：
在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；
在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；
在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；
在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；
收集峰高范围在0.2-1.8AU的馏分，得到次级分离物；
(4)将步骤(3)得到的次级分离物浓缩、干燥后，配制成10mg/mL的供试液并采用制备色谱法分离，色谱条件如下：
采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速1mL/min，柱温30℃，波长为260nm，梯度洗脱程序为：
在0-8min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为75％，流动相B的体积由5％变为25％；
在8-10min的时间范围内，流动相A的体积由75％变为65％，流动相B的体积由25％变为35％；
在10-20min的时间范围内，流动相A的体积由65％变为40％，流动相B的体积由35％变为60％；
在20-24min的时间范围内，流动相A的体积由40％变为20％，流动相B的体积有60％变为80％；
在24-27min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％，收集16-18min的馏分，得到三级分离物；
(5)用HPLC法分离步骤(4)得到的三级分离物，色谱条件如下：
以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，柱温30℃，波长260nm，梯度洗脱程序为：
在0-10min时间范围内，流动相B的体积由5％变为95％，流动相A的体积由95％变为5％，收集5.8-6.2min的馏分，得到四级分离物。


2.根据权利要求1所述的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，其特征在于，步骤(2)中，柱温为30℃，波长为260nm。


3.根据权利要求1所述的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，其特征在于，长裂苦苣菜提取物由包括以下步骤的方法制备得到：
以75％乙醇为溶剂，将长裂苦苣菜制成液料比为30mL/g的提取溶液，调节提取溶液的pH为5，进行超声提取，超声提取后，静置，取上清液，旋转蒸发后冷却干燥，即得。


4.根据权利要求3所述的长裂苦苣菜生物碱四级分离物，其特征在于，超声提取的功率为700W，温度为55℃，超声时间为30min。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀梅，杨培龙，潘方方，石冬冬，闻治国，满晨，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11