一种优选精子的显微操作皿制造技术

本实用新型专利技术公开了一种优选精子的显微操作皿，包括皿盘和皿盖，皿盘上表面凹设有样本池和优选通道，其中，优选通道包括第一通道、第二通道和第三通道，样本池通过第一通道与第二通道的中点连接，在第二通道的中点两侧分别设有若干个诱导室，皿盘上表面还分有精子收集区、精子制动区和显微注射区，第二通道的两头分别通过向上倾斜的第三通道与精子收集区连接，精子制动区和显微注射区在精子收集区附近。利用本实用新型专利技术，可以模拟精子在女性生殖道中的运动轨迹，以及膜连蛋白V对凋亡精子的吸附和孕酮对精子功能的调控，优选出的精子可即刻用于卵胞浆内单精子显微注射，从而有利于提高体外受精的受精率。

A micromanipulation dish for sperm selection

The utility model discloses a micromanipulation dish for optimizing sperm, which includes a dish and a dish cover. The upper surface of the dish is concave with a sample pool and a preferred channel, wherein the preferred channel includes a first channel, a second channel and a third channel, the sample pool is connected with the midpoint of the second channel through the first channel, and two sides of the midpoint of the second channel are respectively provided with several induction chambers, and the upper surface of the dish The two ends of the second channel are connected with the sperm collection area through the third channel which is inclined upward. The sperm collection area and microinjection area are near the sperm collection area. The utility model can simulate the movement track of sperm in the female reproductive tract, the adsorption of apoptotic sperm by annexin V and the regulation of progesterone on sperm function. The optimized sperm can be used for intracytoplasmic sperm microinjection immediately, which is conducive to improving the fertilization rate of in vitro fertilization.

【技术实现步骤摘要】
一种优选精子的显微操作皿
本技术属于辅助生殖
，尤其是涉及一种优选精子的显微操作皿。
技术介绍
人类在自然受精过程中，成熟精子进入女性生殖道，需要经历获能、超激活和顶体反应等生理过程，最终与卵细胞结合完成受精。孕酮在女性生殖道内的分布呈浓度梯度。当精子进入生殖道，低浓度的孕酮能够快速诱导精子胞内钙离子浓度上升，诱导精子获能，随着孕酮浓度增加，显著提高精子的前向运动和超激活运动，并且在其趋化性的引导下游向输卵管壶腹部，当精子与卵细胞相遇后，高浓度的孕酮能够诱发精子发生顶体反应，使得精卵融合，发生受精。孕酮在女性生殖道内的浓度梯度分布，能够在短时间内引起精子细胞内信号通路的激活，有效调控精子的获能、超激活、趋化性等重要生理功能。辅助生殖技术中，筛选形态功能正常、无遗传缺陷的精子是必须的步骤，目前，最常规、最广泛使用的精子优选技术是精子上游法、密度梯度离心法等。其原理主要是基于正常精子与畸形精子、不活动精子及精液中的其他细胞成分在运动能力、运动轨迹和浮力密度等方面出现差异，在培养液或密度梯度溶液柱中运行的能力也有差异，目的是为了获得运动正常的精子。常规的ICSI技术是在倒置显微镜放大200倍条件下，单纯依靠操作者肉眼观察精子的外部形态来选择受精的精子。由于精子筛选方法的局限，操作者只能经验性的依据精子活力和表面形态挑选精子，对优质精子的选择能力十分有限，所选出的所谓“正常”精子可能包含某些生理功能的缺陷，进而影响精卵受精过程和胚胎发育，可能会增加接受治疗的患者子代遗传缺陷方面风险，甚至可能导致ICSI结局失败。因此，发展一种选择性更强、安全、无创的精子优选技术对于提高辅助生殖成功率具有重要的现实意义。
技术实现思路
本技术公开了一种优选精子的显微操作皿，利用该显微操作皿能够筛选出生理功能正常、无遗传缺陷的精子，并进行体外受精操作。一种优选精子的显微操作皿，包括皿盘和皿盖，皿盘上表面凹设有样本池和优选通道，其中，优选通道包括第一通道、第二通道和第三通道，所述样本池通过第一通道与第二通道的中点连接，在第二通道的中点两侧分别设有若干个诱导室。所述的皿盘上表面还分有精子收集区、精子制动区和显微注射区，第二通道的两头分别通过向上倾斜的第三通道与精子收集区连接，所述精子制动区和显微注射区在精子收集区附近。本技术的显微操作皿模拟精子在女性生殖道中的运动轨迹，利用膜连蛋白V对凋亡精子的分离以及诱导剂对精子功能的调控来优选精子，从而提高体外受精的受精率和优胚率。通过将第三通道设置成向上倾斜并与精子收集区连接，使得精子收集区位于皿盘上表面，显微注射针在精子收集区的水平操作时与皿底没有夹角，从而可以顺利的抓取经过优选的精子用于卵胞浆内单精子显微注射。第三通道可以整体都向上倾斜，或者由水平部和倾斜部组合而成，最终保证精子收集区与皿盘上表面齐平。本技术中，所述第一通道、第二通道和第三通道均为直线型通道。作为优选，所述优选通道的长度为25～35mm，所述优选通道的宽度为1.5～2.5mm。优选通道的长度为第一通道、第三通道以及一半的第二通道三者长度之和，如此长度相当于子宫与输卵管的长度之和，更好的模拟女性生殖道对精子的自然选择过程。所述样本池、第一通道和第二通道的深度均为2～3mm。在第二通道中点的两侧，所述诱导室均至少有两个，每个诱导室间隔2～3mm，进一步优选为3～5个，便于多设置几个诱导剂浓度，更好的诱导精子。所述的诱导室凹设在第二通道上，诱导室的长度为2.5～3.5mm，宽度为1.5～2.5mm，深度为1～2mm。由于诱导室凹设在第二通道上，使得诱导室中加入诱导剂后依旧不影响在第二通道上加入精子培养液，保证精子可以穿过诱导室游向精子收集区。作为优选，所述第三通道的倾斜角度为10～30度，进一步优选，倾斜角度为20度。如此倾斜角度的第三通道进一步增加了对精子的选择性，可以挑选出活力更好的精子。作为优选，所述精子制动区和显微注射区位于两个第三通道之间，其中，所述精子制动区靠近第二通道。这样的分布设置，更有利于制动和显微注射的操作。使用所述显微操作皿的进行精子优选的过程如下：(1)第一通道用膜连蛋白V进行预处理，4℃保存待用。(2)在诱导室中分别加入不同浓度的诱导剂，使诱导室内诱导剂的浓度从第二通道的中点至第三通道依次变大；(3)向样本池、优选通道和精子收集区内加入精子培养液，并覆盖矿物油，盖上皿盖，放入37℃、5％二氧化碳培养箱内平衡30min；(4)将适量精子样本加入样本池，盖上皿盖，放入37℃、5％二氧化碳培养箱内30～60min，使生理功能和受精能力正常的精子游到精子收集区；(5)在精子制动区加入高粘度的精子制动液，在倒置显微镜下用显微注射针从收集区吸取精子，移至精子制动区制动精子；(6)将制动后的精子移至显微注射区，在显微注射区完成卵胞浆内单精子显微注射操作。其中，作为优选，所述的诱导剂为孕酮或其衍生物的琼脂培养基。步骤(1)中，第一通道用膜连蛋白V进行预处理的具体过程为：用血清白蛋白37℃孵育30-60min，用PBS缓冲液洗涤，用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(3-(2-pyridyldithio)propionicacidN-hydroxysuccinimideester，SPDP)室温下孵育1小时。再在室温下加二硫苏糖醇孵育1小时清除二硫基。然后用含有SPDP(1mg/ml)的醋酸钠缓冲液(PH4.5，50mM)室温孵育1小时后，用醋酸钠缓冲液洗涤，再与含膜连蛋白V(100μg/ml)的PBS缓冲液孵育2-3小时，最后用含1mM二硫苏糖醇的PBS洗涤，晾干，4℃保存待用。精子凋亡是影响精卵受精成功率的一个重要因素。膜连蛋白V(AnnexinV)是检测精子凋亡的灵敏指标之一。精子凋亡时，精子膜上磷脂酰丝氨酸由胞膜内侧翻向外侧，而膜连蛋白V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度的亲和力。利用精子膜外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与膜连蛋白V结合的特征可区分凋亡精子。精子细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻要早于细胞核的变化，故膜连蛋白V还可以更早地检测到凋亡精子，凋亡精子与膜连蛋白V共价结合而被吸附住，正常精子自由通过，因此，可以快速、有效去除凋亡精子。孕酮琼脂培养基通过人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液配置。人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液的成份为：氯化钾5.06mM、氯化钠90mM、氯化钙1.8mM、碳酸氢钠25.3mM、硫酸镁1.01mM、磷酸二氢钾1.17mM。不同浓度的孕酮琼脂培养基的配置过程如下：用人输卵管液无机盐成分等渗溶液配制2％的琼脂，灭菌后，等琼脂冷却至56℃左右，量取一定体积琼脂分别置于若干个不同试管，并配成含5.00μM和10.00μM等不同梯度的孕酮琼脂培养基，混匀，并迅速将不同浓度琼脂培养基分别注满不同的诱导室。等琼脂冷却凝固，并加盖置4℃保存。与现有技术相比，本技术具有以下有益本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种优选精子的显微操作皿，包括皿盘和皿盖，其特征在于，皿盘上表面凹设有样本池和优选通道，其中，优选通道包括第一通道、第二通道和第三通道，所述样本池通过第一通道与第二通道的中点连接，在第二通道的中点两侧分别设有若干个诱导室；/n所述的皿盘上表面还分有精子收集区、精子制动区和显微注射区，第二通道的两头分别通过向上倾斜的第三通道与精子收集区连接，所述精子制动区和显微注射区在精子收集区附近。/n

【技术特征摘要】
1.一种优选精子的显微操作皿，包括皿盘和皿盖，其特征在于，皿盘上表面凹设有样本池和优选通道，其中，优选通道包括第一通道、第二通道和第三通道，所述样本池通过第一通道与第二通道的中点连接，在第二通道的中点两侧分别设有若干个诱导室；
所述的皿盘上表面还分有精子收集区、精子制动区和显微注射区，第二通道的两头分别通过向上倾斜的第三通道与精子收集区连接，所述精子制动区和显微注射区在精子收集区附近。


2.根据权利要求1所述的优选精子的显微操作皿，其特征在于，所述第一通道、第二通道和第三通道均为直线型通道。


3.根据权利要求1所述的优选精子的显微操作皿，其特征在于，所述优选通道的长度为25～35mm，宽度为1.5～2.5mm。


4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚梅，李坤，张松英，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：新型
国别省市：浙江;33