一种耳聋模型猪的重构卵及其构建方法，耳聋模型猪、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种耳聋模型猪的重构卵及其构建方法，并公开了了一种耳聋模型猪、构建方法及其应用。本发明专利技术的耳聋模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法通过敲除猪OSBPL2基因获得了耳聋小型猪的重构卵，结合CRISPR/Cas9基因编辑技术、体细胞核移植技术和胚胎移植技术，证明该方法用于构建基因修饰的耳聋猪模型的高效性与可行性。通过该方法可以精确复制人OSBPL2基因突变的基因型和耳聋表型，获得的OSBPL2基因敲除猪具有典型的人类常染色显性遗传性耳聋(DFNA67)的特征，可为人类遗传性耳聋的疾病研究提供可靠的大动物模型，并可应用于内耳的基因修复、内耳毛细胞再生与听力重建等。

A kind of reconstructed egg of deafness model pig and its construction method, deafness model pig, construction method and its application

The invention discloses a reconstructed egg of a deafness model pig and a construction method thereof, and also discloses a deafness model pig, a construction method and an application thereof. The reconstituted egg of the deafness model pig and its construction method and the construction method of the model pig obtained the reconstituted egg of the deafness miniature pig by knocking out the osbpl2 gene of the pig. In combination with CRISPR / cas9 gene editing technology, somatic cell nuclear transfer technology and embryo transfer technology, it is proved that the method is efficient and feasible for constructing the genetically modified deafness pig model. By this method, the genotype and deafness phenotype of human osbpl2 gene mutation can be accurately duplicated. The obtained osbpl2 gene knockout pig has the characteristics of typical human autostained dominant deafness (dfna67), which can provide a reliable animal model for the study of human hereditary deafness, and can be applied to gene repair, hair cell regeneration and hearing reconstruction of inner ear.

【技术实现步骤摘要】
一种耳聋模型猪的重构卵及其构建方法，耳聋模型猪、构建方法及其应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种耳聋模型猪的重构卵及其构建方法，耳聋模型猪、构建方法及其应用。
技术介绍
耳聋是最常见的感知性障碍疾病，据世界卫生组织(WHO)最新统计，全球听力残疾人口约4.66亿，其中近3400万为儿童，新生儿耳聋发病率为0.1-0.3％。50％的耳聋患者发病与遗传因素有关，根据是否伴有耳外组织异常、病变或系统性疾病，遗传性耳聋分为综合征型耳聋(SyndromicHearingLoss,SHL)和非综合型耳聋(Non-syndromicHearingLoss,NSHL)，NSHL约占70％。常染色体显性遗传性耳聋(DFNA)和常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB)是NSHL最主要的遗传模式(http://hereditaryhearingloss.org/)，其中DFNB多表现为语前聋和全频听力下降，听力损失程度较重，而DFNA多表现为迟发性和进行性的听力损失。因DFNA发病涉及生长发育多个阶段，新生儿听力筛查往往难以识别，其危害性更难本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耳聋模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)针对猪物种的OSBPL2基因的OSBP指纹基序编码序列及其上游编码序列设计gRNA识别序列，所述OSBPL2基因的OSBP指纹基序编码的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述OSBP指纹基序编码序列核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述OSBP指纹基序编码序列及其上游编码序列如SEQ ID No:3所示；/n(2)对所述gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有该gRNA识别序列的双链DNA；/n(3)构建含Cas9骨架以及步骤(2)中所述双链DNA的gRNA表达载体；/n(4)将步骤(3)中所述gRNA表达载...

【技术特征摘要】
1.一种耳聋模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对猪物种的OSBPL2基因的OSBP指纹基序编码序列及其上游编码序列设计gRNA识别序列，所述OSBPL2基因的OSBP指纹基序编码的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，所述OSBP指纹基序编码序列核苷酸序列如SEQIDNo:2所示，所述OSBP指纹基序编码序列及其上游编码序列如SEQIDNo:3所示；
(2)对所述gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有该gRNA识别序列的双链DNA；
(3)构建含Cas9骨架以及步骤(2)中所述双链DNA的gRNA表达载体；
(4)将步骤(3)中所述gRNA表达载体转染猪胎儿成纤维细胞，筛选出OSBPL2基因敲除的阳性克隆细胞；
(5)将步骤(4)筛选得到的阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞，形成重构卵。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述gRNA识别序列或其互补序列与所述OSBPL2基因的OSBP指纹基序编码序列及其上游编码序列部分一致或为相应的同义突变。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA识别序列如SEQIDNo:4、SEQIDNo:5或SEQIDNo:6所示。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，当所述gRNA识别序列如SEQIDNo:4所示，所述正向寡核苷酸序列如SEQIDNo:7所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQIDNo:10所示；当所述gRNA识别序列如SEQIDNo:5所示，所述正向寡核苷酸序列如SEQIDNo:8所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQIDNo:11所示；当所述gRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹新，姚俊，曾华沙，杨海元，王盈，邢光前，陈智斌，魏钦俊，鲁雅洁，戴一凡，
申请(专利权)人：南京医科大学，江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32