胞内劳森菌的培养方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种胞内劳森菌的培养方法，包括以下步骤：步骤1：贴壁培养猪肠道细胞；步骤2：待细胞贴壁培养6～8h，将胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.01～1:1接种至细胞中，置于改良的微需氧环境中培养1～96h；步骤3：胰酶消化感染的细胞后，收集感染细胞，并用细胞冻存液重悬感染细胞，转入液氮罐中保存。还公开由所述的培养方法培养的胞内劳森菌的应用，应用于胞内劳森菌分离培养和病原性特征的研究中。本发明专利技术应用猪肠道细胞来培养胞内劳森菌，严格模拟宿主体内的体外培养环境，并且应用改良后的微需氧培养箱来培养胞内劳森菌，操作简单，培养周期短，成本低，大大增加培养胞内劳森菌的成功率。

Culture method and application of Lawsonia intracytogenes

The invention discloses a culture method of intracellular Lawsonia, which comprises the following steps: Step 1: culturing pig intestinal tract cells by adherent culture; step 2: inoculating the cell with the cell culture medium according to the volume ratio of 0.01-1:1 to the cell after adherent culture for 6-8h, culturing the cells in the improved micro aerobic environment for 1-96h; step 3: collecting the infected cells after trypsin digests the infected cells The infected cells were resuspended with cell cryopreservation solution and transferred to liquid nitrogen tank for preservation. It also discloses the application of the culture method of Lawsonia in the isolation and culture of Lawsonia and the study of pathogenic characteristics. The invention applies pig intestinal cells to culture larcenella, strictly simulates the in vitro culture environment of the host body, and applies the improved micro aerobic incubator to culture larcenella. The operation is simple, the culture cycle is short, the cost is low, and the success rate of culturing larcenella is greatly increased.

【技术实现步骤摘要】
胞内劳森菌的培养方法及应用
本专利技术属于兽用生物
，具体涉及一种胞内劳森菌的培养方法及应用。
技术介绍
胞内劳森菌(LawsoniaIntracellularis，LI)属于脱硫弧菌属，革兰氏阴性菌，呈弧形弯曲状、逗点状或S形，大小为1.25～1.75μm×0.25～0.43μm，专性寄生于动物肠道细胞中，可引起以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞腺瘤样增生为特征的猪增生性肠炎(PPE)。虽PPE死亡率不高，但该病可引起病猪腹泻、生长缓慢等临床症状，严重降低动物的饲料利用率，进而造成巨大的经济损失。据报道，美国和英国每年因PPE造成的损失分别高达2000万美元、400万英镑。在欧洲，估计每年该病对每头育肥猪造成的损失超过1欧元。此外，该病呈世界规模流行，感染率非常高。据报道，加拿大、芬兰、巴西、法国、南非、希腊、泰国、印度、日本、朝鲜、中国等20多个国家均有LI感染，特别是在欧美国家发病率较高。在自然界中LI能通过多种途径传播，如鸟类、鼠、昆虫等动物性传播，人员、设备、车辆等流动性传播。为了更好地防治PPE，LI的培养和鉴定显得尤为重要。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：贴壁培养猪肠道细胞；/n步骤2：待所述猪肠道细胞贴壁培养6～8h，将胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.01～1:1接种至细胞中，置于改良的微需氧环境中培养1～96h；/n步骤3：胰酶消化感染步骤2中培养的细胞后，收集感染细胞，并用细胞冻存液重悬感染细胞，转入液氮罐中保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：贴壁培养猪肠道细胞；
步骤2：待所述猪肠道细胞贴壁培养6～8h，将胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.01～1:1接种至细胞中，置于改良的微需氧环境中培养1～96h；
步骤3：胰酶消化感染步骤2中培养的细胞后，收集感染细胞，并用细胞冻存液重悬感染细胞，转入液氮罐中保存。


2.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，所述猪肠道细胞为猪空肠上皮细胞IPEC-J2、猪小肠上皮细胞ZYM-DIEC02或猪小肠上皮细胞IPEC-1。


3.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，步骤1中贴壁培养细胞，具体包括以下步骤：
S1：从液氮罐取出细胞，迅速在37℃水浴锅中摇晃，并在1min之内完全融化；
S2：将融化的细胞加入DMEM完全培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养；所述细胞在完全培养基中的浓度为0.5×106/mL～2×108/mL；
S3：待细胞贴壁生长后，用PBS缓慢清洗细胞2～3次，待细胞汇合度达到80％～90％时，用胰酶消化细胞，将细胞悬液混匀并平铺于24孔板中，每孔中细胞悬液和DMEM完全培养基按体积比1:9加入，混匀后于培养箱中培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢书宇，陈冬梅，袁宗辉，罗万和，武梦茹，孟奎宇，潘源虎，瞿玮，程古月，黄玲利，谢长清，王旭，陶燕飞，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42