The invention relates to a composition and a method for detecting a target molecule and an amplification of a detectable signal generated by a detection determination. More specifically, the invention relates to a method for generating and / or amplifying signals indicative of the presence of target molecules (E. G., nucleic acids and proteins) using a catalytic nuclease and a composition for the method.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测级联
本专利技术涉及用于检测靶标分子的组合物和方法以及通过检测测定产生的可检测信号的扩增。更具体地，本专利技术涉及利用催化核酸酶产生和/或扩增指示靶标分子(例如核酸和蛋白质)存在的信号的方法以及用于该方法的组合物。
技术介绍
目前有许多测定可用于检测样品中的靶标核酸或其他分子。大多数测定法依赖于蛋白质酶的使用，而少数测试法利用如下所述的催化核酸修饰的核酸酶。-催化核酸酶催化核酸酶是能够修饰特定底物的非蛋白质酶。催化核酸酶包括DNA分子(在本领域中也称为脱氧核酶(DNAzyme)、脱氧核酶(deoxyribozyme)或DNA酶(DNAenzyme))、RNA分子(本领域中也称为核酶)，以及由多个DNA和/或RNA分子组成的多组分核酸酶(在本领域中也称为MNA酶或PlexZyme)。催化核酸酶可以通过例如切割或连接来修饰特定的核酸底物序列。一类独特的催化核酸酶(本领域称为辣根过氧化物酶-模拟脱氧核酶)可催化过氧化物酶反应，将特定的化学底物转化为其氧化产物，例如，可产生颜色变化或发出荧光或化学发光信号。能够切割或连接RNA底物、DNA底物和/或嵌合DNA/RNA底物的脱氧核酶和核酶通常只能修饰满足最小序列要求的靶标核酸底物。例如，底物应该表现出与酶的底物结合臂(bindingarm)足够的碱基对互补性，并且还需要在催化修饰位点处的特定序列。催化切割位点上此类序列要求的实例包括对脱氧核酶切割的嘌呤：嘧啶序列(10-23型)的要求、对二核苷酸连接(8-17型)的要求以及对序列尿苷：X的要求，其中对...
【技术保护点】
1.一种用于确定样品中存在靶标的方法，所述方法包括：/n-提供反应混合物，所述反应混合物包含：/n多核苷酸A群(PA)和多核苷酸B群(PB)，其中/n每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，/n每个PB多核苷酸包含催化核酸B和催化核酸底物B，/n所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B，且/n所述催化核酸B能够催化性修饰所述催化核酸底物A；/n选择性可渗透屏障，其能够将所述PA与所述PB物理分离，其中所述PA和PB不能渗透所述选择性可渗透屏障，并且所述PA和/或PB在所述反应混合物中是可移动的；和/n(iii)两种寡核苷酸，其各自能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一种寡核苷酸能够与靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的催化核酸C；
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170411 AU 20179013211.一种用于确定样品中存在靶标的方法，所述方法包括：
-提供反应混合物，所述反应混合物包含：
多核苷酸A群(PA)和多核苷酸B群(PB)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含催化核酸B和催化核酸底物B，
所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B，且
所述催化核酸B能够催化性修饰所述催化核酸底物A；
选择性可渗透屏障，其能够将所述PA与所述PB物理分离，其中所述PA和PB不能渗透所述选择性可渗透屏障，并且所述PA和/或PB在所述反应混合物中是可移动的；和
(iii)两种寡核苷酸，其各自能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一种寡核苷酸能够与靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的催化核酸C；或者
(iv)催化酶D，其能够切割通过靶标与所述PA的杂交形成的核酸双链体的一条或多条链；
-接触：
(i)使所述PA、所述PB及所述寡核苷酸与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PA与所述PB分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述两种寡核苷酸中的每一种与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并且至少一种进一步与靶标杂交，从而形成切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸C，从而释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；或者
(ii)使所述PA、所述PB及所述催化酶D与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PA与所述PB分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述靶标与PA多核苷酸杂交形成包含所述催化酶D的识别和切割位点的所述核酸双链体，
所述催化酶D的所述切割位点不在所述催化核酸A内，并且
所述催化酶D在所述切割位点处结合并切割所述核酸双链体，释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
-其中：
释放的催化核酸A移动通过所述可渗透屏障，与PB多核苷酸的所述催化核酸底物B杂交，并切割所述PB多核苷酸，从而释放所述PB多核苷酸的所述催化核酸B，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
释放的催化核酸B移动通过所述可渗透屏障，与第二PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并切割所述第二PA多核苷酸，从而释放所述第二PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
并且
检测到任何所述PA和/或PB多核苷酸的切割表明样品中存在靶标。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述催化核酸A不能催化性修饰催化核酸底物A，和/或
所述第二多核苷酸的所述催化核酸B不能催化性修饰所述催化核酸底物B。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述催化核酸C不能切割所述PB多核苷酸的所述催化核酸底物B。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述反应混合物多核苷酸中可移动的所述PA和/或PB的任一个包含：
附着的组分，和/或，
提供二级结构的自身互补区域，和/或
带电部分；
其防止所述多核苷酸渗透穿过所述选择性可渗透屏障。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中：
所述催化核酸底物A的所述切割从所述PA多核苷酸的所述催化核酸A释放所述附着的组分或所述自身互补区域，所述催化核酸A因此能够移动通过所述可渗透屏障，和/或
所述催化核酸底物B的所述切割从所述PB多核苷酸的所述催化核酸B释放所述附着的组分或所述自身互补区域，所述催化核酸B因此能够移动通过所述可渗透屏障。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述催化核酸A和/或所述催化核酸B是脱氧核酶或核酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸A和/或所述催化核酸B选自由8-17脱氧核酶、10-23脱氧核酶、9-86脱氧核酶、12-91脱氧核酶、GR-5脱氧核酶、17E脱氧核酶、RFD-EC1脱氧核酶、F-8脱氧核酶、39-E脱氧核酶、E2脱氧核酶、Mg5脱氧核酶、A43脱氧核酶、DAB22脱氧核酶、PS2.M脱氧核酶、锤头状核酶、L-组氨酸依赖性脱氧核酶和HRP脱氧核酶组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸A和所述催化核酸B各自是不同种类的脱氧核酶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中：
(i)所述催化核酸A是10-23脱氧核酶，且所述催化核酸B是8-17脱氧核酶；和
所述催化核酸底物A是8-17脱氧核酶的底物，且所述催化核酸底物B是10-23脱氧核酶的底物；或者
(ii)所述催化核酸A是8-17脱氧核酶，且所述催化核酸B是10-23脱氧核酶；和
所述催化核酸底物A是10-23脱氧核酶的底物，且所述催化核酸底物B是8-17脱氧核酶的底物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
提供所述两种寡核苷酸，每种寡核苷酸能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性地杂交，并且至少一种能够与所述靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的所述催化核酸C；
所述靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
所述催化核酸C包含能够与所述靶标结合的适体部分；
所述方法进一步包括使所述样品与抑制剂接触，所述抑制剂与所述适体杂交，从而使催化核酸C失活；
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；并且
当存在于所述样品中时，所述靶标与所述适体结合，取代所述抑制剂并使所述催化核酸C具有活性，从而促进所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的切割。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
并且
所述两种寡核苷酸是只有在所述靶标存在下能够自组装以形成所述MNA酶的两种部分酶寡核苷酸。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
所述两种寡核苷酸是只有在所述靶标存在下能够自组装以形成所述MNA酶的两种部分酶寡核苷酸，
所述靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；并且
所述两种部分酶寡核苷酸各自在所述自组装期间与所述多核苷酸杂交以形成所述MNA酶。
14.根据权利要求12所述的方法，其中：
所述靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
所述两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与所述靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
所述方法进一步包括使所述样品与MNA酶组装易化子寡核苷酸接触，所述组装易化子寡核苷酸促进所述两种部分酶寡核苷酸自组装成MNA酶，以及与抑制剂分子接触，所述抑制剂分子与适体杂交，使得所述MNA酶催化性失活；
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；并且
所述靶标与所述适体部分杂交，除去所述抑制剂并使所述MNA酶具有催化性活性。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
所述靶标是多核苷酸，
所述催化酶D是内切核酸酶或外切核酸酶。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中
所述催化核酸A从所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的释放和/或所述催化核酸B从所述PB多核苷酸的所述催化核酸底物B的释放将荧光团与猝灭剂分离，从而提供信号以便于检测所述靶标。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其中所述检测包括
从所述反应混合物中分离所述释放的催化核酸A和/或所述释放的催化核酸B；
在适合于通过所述催化核酸切割所述催化核酸底物的条件下，将所分离的催化核酸应用于包含催化核酸底物A和/或催化核酸底物B的第二反应混合物；和
检测通过所述催化核酸对所述催化核酸底物的切割。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述检测包括实时定量所述释放的催化核酸A和/或所述释放的催化核酸B。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，包括：
少于5个、少于6个、少于7个、少于8个、少于9个、少于10个、少于15个或少于20个的所述PA多核苷酸的切割，和/或
少于5个、少于6个、少于7个、少于8个、少于9个、少于10个、少于15个或少于20个的所述PB多核苷酸的切割，
以便于检测靶标。
20.一种用于确定样品中靶标的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)多核苷酸A群(PA)、多核苷酸B群(PB)和多核苷酸C群(PC)，
其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B1和催化核酸底物B，
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2，
其中：
所述部分酶寡核苷酸B1的底物臂能够与所述催化核酸底物A杂交，
所述部分酶寡核苷酸B2的底物臂能够与所述催化核酸底物A杂交，并且
所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B；
(ii)组装易化子寡核苷酸，其能够与部分酶寡核苷酸B1的传感器臂和部分酶寡核苷酸B2的传感器臂杂交；
(iii)能够将所述PA与所述PB物理分离的选择性可渗透屏障，其中所述PA和所述PB不能渗透所述选择性可渗透屏障，所述PA、PB和PC在所述反应混合物中可移动；以及下列之一：
(iv)两个部分酶寡核苷酸C1和C2各自能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一个能够与所述靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的催化核酸C；
或者
(v)能够切割通过所述靶标与所述PA杂交形成的核酸双链体的一条或多条链的催化酶D；
和
(b)接触：
(i)使所述部分酶寡核苷酸C1和C2与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PB与所述PA分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述部分酶寡核苷酸C1和C2的每一种的底物臂与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并且所述部分酶寡核苷酸C1和C2中的至少一种与所述靶标杂交形成所述催化核酸C，所述催化核酸C切割所述PA多核苷酸，从而释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
或者
(ii)使所述催化酶D与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PB与所述PA分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述靶标与PA多核苷酸杂交形成包含所述催化酶D的识别和切割位点的核酸双链体，
所述催化酶D的切割位点不在所述催化核酸A内，并且
所述催化酶D在所述切割位点处结合并切割所述核酸双链体，释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
其中：
所述释放的催化核酸A移动通过所述可渗透屏障，与PB多核苷酸的所述催化核酸底物B杂交，并切割所述PB多核苷酸，从而释放所述PB多核苷酸的所述部分酶寡核苷酸B1，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
所述释放的部分酶寡核苷酸B1移动通过所述可渗透屏障，部分酶寡核苷酸B1和B2的每一种的传感器臂与所述组装易化子寡核苷酸杂交，并且部分酶寡核苷酸B1和B2的每一种的底物臂与第二PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，从而形成催化核酸B，所述催化核酸B切割所述第二PA多核苷酸，从而释放所述第二PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
和
检测到任何所述PA和/或PB多核苷酸的切割表明所述样品中存在所述靶标。
21.根据权利要求20所述的方法，其中：
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和能被催化核酸A切割的催化核酸底物B，
释放的催化核酸A切割所述PC多核苷酸，从而释放所述PC多核苷酸的所述部分酶寡核苷酸B2，和
检测到任何PC多核苷酸的切割表明所述样品中存在所述靶标。
22.根据权利要求20所述的方法，其中
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和催化核酸底物A，和
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述部分酶寡核苷酸C1和C2的每一种的底物臂与所述PC多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·V·托德，N·J·哈西克，
申请(专利权)人：斯皮德斯私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU
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