用于核酸样品标准化的方法技术

本发明专利技术提供了一种样品标准化的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与识别靶序列的、限定量的单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的核酸分子以产生标准化量的第一切割产物；(b)分离、转录或选择性扩增所述标准化量的第一切割产物。在所述方法中，因为使用限定量的核酸内切酶，所以第一切割产物的标准化量通过步骤(a)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定。

Methods for standardization of nucleic acid samples

The invention provides a method for sample standardization. In some embodiments, the method includes: (a) reacting a sample with a defined amount of single turnover sequence specific endonuclease identifying the target sequence to cut a portion of the nucleic acid molecule containing the target sequence to produce a standardized amount of the first cut product; and (b) separating, transcribing or selectively amplifying the standardized amount of the first cut product. In the method, since a limited amount of nuclease is used, the standardized amount of the first cut product is determined by a limited amount of first single turnover sequence specific nuclease used in step (a).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸样品标准化的方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年1月19日提交的英国专利申请No.1700941.6的权益，该申请通过引用并入本专利技术。
技术介绍
许多分子学实验方案，例如制备测序文库、片段化、接头连接、片段化的同时添加标签(tagmentation)等，都需要样品的浓度在可接受的工作范围内。在实验室中，通常通过测量样品中核酸的浓度，然后在实验方案的下个步骤中仅使用适当量的样品(等分试样或其稀释样)来实现。该过程称为“标准化”，由此产生的样品具有基本上等量的核酸分子。在许多情况下，样品在合并之前被标准化，以确保在该方法的下一步骤中处理相同量的每种样品。常规的标准化方法涉及物理测量样品中核酸的量、进行计算，然后对样品进行适当调整。这些方法通常耗时、费力，并且容易出现人为的错误。此外，某些方法会损失掉一些样品、发生样品变性和/或需要专用的实验室设备。由于不能自动化，在许多情况下(特别是在高通量实验室中)标准化步骤为限速步骤。因此，需要更好的样品标准化的方法。专利技术概述本专利技术提供了用于样品标准化的各种方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与限定量的识别靶序列的单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的核酸分子并产生标准化量的第一切割产物；(b)分离、转录或选择性扩增所述标准化量的第一切割产物。在所述方法中，因为使用限定量的核酸内切酶，所以通过步骤(a)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定第一切割产物的标准化量。在进行所述方法时，切割产物(可含有目的序列)的量的增加或减少与所用核酸内切酶的量成正比。例如，如果反应中核酸内切酶的量加倍，那么产物的量也应该加倍(当然，假设存在过量的起始原料)。所述方法特别适用于标准化样品内或样品间的两种或更多种核酸(例如，基因或扩增产物等)的量。具体地，如以下将更加详细讨论的内容，单个样品可以与限定量的两种或更多种识别不同靶序列的单周转序列特异性核酸内切酶反应。在这些实施方案中，所产生的不同切割产物的相对量应该与所述反应中所述核酸内切酶的相对量成正比。例如，如果想要产生摩尔比为1:1的两种切割产物，则可以使用相同限定量的两种或多种单周转序列特异性核酸内切酶。在另一个实施例中，两种或多种不同的样品可以与相同的单周转序列特异性核酸内切酶反应。在这些实施方案中，反应中产生的切割产物的相对量应该与反应中使用的核酸内切酶的相对量成正比。在该实施例中，如果想要从两个不同的反应中产生相同摩尔量的切割产物，则可以在反应中使用相同限定量的单周转序列特异性核酸内切酶。其他标准化的方法(例如，涉及在进行反应之前测量样品中核酸的量的方法，或涉及将样品与限定量的寡核苷酸杂交的方法)劳动强度大，需要极好的设备，通常需将样品变性，和/或是不准确的。因此，本方法被认为是对本领域的重要贡献。此外，本方法可用于标准化样品内(不仅仅是样品之间)的特定序列的量。因此，本方法特别适用于需要在分析之前标准化来自单个样品的多个序列(例如，多个基因座或扩增产物等)的方法。可以使用本标准化的方法中所用的样品或本标准化方法的产物，而无需使用例如，荧光测定法或光密度测定法来量化样品中核酸的确切含量，尽管可以检查所述样品或产物以确定其是否其含有核酸。另外，因为所述核酸内切酶是序列特异性的，所以该方法可用于富集特定序列(例如，特定基因座)。因此，在一些实施方案中，所述方法标准化并且富集了所述样品中的特定序列(例如，特定基因座)。通过以下描述，其他实施、实施方案和优势可以是显而易见的。附图说明本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。图1示意性地说明了本方法的一个实施例，其在四个样品中对由粗线和细线表示的两种扩增子进行标准化。在该实施例中，生物素由白色圆圈表示，孔的底部包被有链霉亲和素。如图所示，初始样品中扩增子的分子数量不同。如图的上部所示，双链扩增子通过5'生物素与链霉亲和素包被的平板结合。如图所示，四个孔具有不同数量的粗线和细线的扩增子分子。在下一步骤中，拴系的扩增子与单周转、序列特异性核酸内切酶(例如Cas9-RNA)反应，所述单周转、序列特异性核酸内切酶经过特别设计以用于识别粗线和细线的扩增子。在该实施例中，将一个分子的识别细线的扩增子的单周转、序列特异性核酸内切酶和两个分子的识别粗线的扩增子的单周转、序列特异性核酸内切酶添加到每个孔中，并完成反应。接下来，分离所得的切割产物。在所示方法中，将上清液移至新板中。将反应标准化并获得所需浓度的粗线/细线的扩增子。在所示的实施例中，每个标准化的样品含有相同数量的分子，并且每个样品仅包含一个细线的扩增子和两个粗线的扩增子。定义在进一步描述本专利技术之前，应理解本专利技术不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以有所变化。还应理解，本专利技术使用的术语仅仅为的是用于描述特定实施方案，而不是限制性的，因此本专利技术的范围仅受所附权利要求的限制。除非另有定义，否则本专利技术使用的所有技术术语和科学术语与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与本专利技术描述的那些类似或等同的方法和材料均可用于本专利技术的实践或测试，但现在只描述了优选的方法和材料。本专利技术提及的所有出版物均通过引用并入本专利技术，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。必须注意的是，如本专利技术和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”、“和”与“所述”包括复数的所指事物。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种这样的抗体，提及“一种框架区”包括提及一种或多种框架区及本领域技术人员已知的它的等同物，等等。本专利技术讨论的出版物仅仅是为了提供在本申请的提交日之前的公开内容。本专利技术中的任何内容均不应被解释为承认本专利技术无权凭借在先专利技术而先于这些出版物公开。此外，提供的出版物的日期可能与实际公开日期不同而需要单独确认。术语“样品”是指来自生物来源的核酸样品。样品可以来自动物，包括人类、流体、固体(例如，粪便)或组织，以及液体、固体食物以及饲料产品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，以及废物。生物样品可包括取自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰液、精液、针吸物等。生物样品可以从所有各科家畜，以及各科野生动物或野兽中获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等动物。环境样品包括环境材料，例如地表物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和乳制品加工仪器、装置、设备、器具、一次性和非一次性物品获得的样品。这些实例不应被解释为限制适用于本专利技术的样品类型。涉及基因组或靶多核苷酸的“基因座位”、“基因座”、“基因”或“目标基因座”是指基因组或靶多核苷酸的连续亚区或区段。如本专利技术所用，基因座位、基因、基因座或目标基因座可以指核苷酸、基因或基因的一部分在基因组中的位置，包括线粒体DNA或其他非染色体DNA(例如，细菌质粒)，或者它可以指基因组序列的任何毗连部分，无论其是否在基因内或与基因相关。基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种样品标准化的方法，其包括：/n(a)获得包含核酸的样品；/n(b)将所述样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上；/n(c)使(b)中拴系的核酸分子与识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中，和/n(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物；/n其中，步骤(d)中分离的所述第一切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的第一核酸向导的核酸内切酶来确定。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170119 GB 1700941.61.一种样品标准化的方法，其包括：
(a)获得包含核酸的样品；
(b)将所述样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上；
(c)使(b)中拴系的核酸分子与识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中，和
(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物；
其中，步骤(d)中分离的所述第一切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的第一核酸向导的核酸内切酶来确定。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品中的所述核酸是扩增产物。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增产物包含PCR产物。


4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(c)包括：
(c)使(b)中拴系的核酸分子与：
(i)识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中；以及
(ii)识别样品中的第二靶序列的、限定量的第二核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述第二靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第二切割产物释放到溶液中；和
步骤(d)包括：
(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物和所述第二切割产物；
其中，步骤(d)中分离的所述第一和切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的所述第一核酸向导的核酸内切酶和所述第二核酸向导的核酸内切酶来确定。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一核酸内切酶切割第一扩增产物，且所述第二核酸内切酶切割第二扩增产物中的序列。


6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述第一扩增产物和所述第二扩增产物在不同的反应中制备，然后合并在一起。


7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述第一扩增产物和所述第二扩增产物在相同的反应中制备。


8.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·格罗博纳，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG