自引导整合构建体(SGIC)制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学和细胞生物学领域。更特别地，本发明专利技术涉及用于基因组编辑系统的自引导整合构建体。

Self guided Integration Architecture (sgic)

The invention relates to the field of molecular biology and cell biology. More particularly, the invention relates to a self guided integrated construct for a genome editing system.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自引导整合构建体(SGIC)
本专利技术涉及分子生物学和细胞生物学领域。更特别地，本专利技术涉及用于基因组编辑系统的自引导整合构建体。
技术介绍
多核苷酸引导的核酸酶系统也称为多核苷酸引导的基因组编辑系统，其是已用于基因组编辑和基因调控的强大工具，其中最着名的是CRISPR/Cas9系统。该工具至少需要多核苷酸引导的核酸酶(诸如Cas9)和引导多核苷酸(诸如引导RNA)，所述引导多核苷酸使得基因组编辑酶能够靶向DNA的特定序列。此外，为了以精确方式编辑基因组，主要需要供体多核苷酸，诸如供体DNA，尤其是当依赖于用于在基因组中的期望位点进行精确编辑的同源重组而不是依赖于通过随机修复过程(诸如非同源末端连接)进行的修复时。对于每个靶位点，需要设计和合成供体多核苷酸。另外，对基因组中的靶位点特异的引导多核苷酸需要进行设计，并且需要在细胞内表达或需要在体外表达并引入细胞中。对于使用CRISPR/Cas9系统的靶向修饰，需要使用对靶标特异的供体多核苷酸和引导多核苷酸的组合。尤其是对于多重方法，诸如当筛选例如敲除文库、敲低文库或启动子替换文库时，因为包含引导多核苷酸或引导多核苷酸表达构建体的匹配组合物和匹配供体多核苷酸将必须一起转化，所以实验工作非常艰巨。为了在一个实验中筛选多种靶标和/或多种修饰，现有技术设置需要加入和使用多样的多核苷酸，以及甚至更大量的对包含期望性质的细胞的筛选。因此，持续迫切需要开发改进且简化的引导多核苷酸和供体多核苷酸工具。附图说明图1描绘了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN061的载体图谱，其表达经密码子对优化的Cas9以用于在S.cerevisiae中表达。CPOCas9由KluyveromyceslactisKLLA0F20031g启动子和S.cerevisiaeGND2终止子表达。KanMX标记盒存在于载体上，其赋予对G418的抗性以允许在平板上或在液体培养物中选择转化体。TRP1标记允许用trp1营养缺陷型来在酵母菌株中选择质粒。图2描绘了多拷贝(2微米)载体pRN1120的载体图谱。NatMX标记盒存在于载体上，其赋予对诺尔丝菌素的抗性以允许在平板上或在液体培养物中选择转化体。该载体用于用于在使用EcoRI和XhoI进行线性化后使sgRNA表达盒体内重组。图3描绘了如实施例1中所述使用CRISPR/Cas9系统在Saccharomycescerevisiae中整合自引导整合构建体(SGIC)型引导RNA表达盒。SGIC在5'末端和3'末端处包含50bp侧翼，所述50bp侧翼与基因组DNA序列具有序列同一性以允许经由同源重组在期望基因组基因座(INT1、INT59或YPRCtau3)处进行整合。取决于所述侧翼的序列，整合SGIC后多至1kbp的一段DNA从基因组中缺失。3A：没有侧翼对照；3B：0kB缺失；3C：1kB缺失；3D：没有SGIC片段。图4描绘了两种SGIC分裂引导RNA片段(SGICsplitguide-RNAfragment)，所述两种SGIC分裂引导RNA片段基本上是实施例1中提出的SGIC的两个半部，彼此具有80bp的重叠同源性以允许体内(在酵母细胞内)装配功能性SGIC。经装配的功能性SGIC引导RNA包含引导RNA表达盒和在5'末端和3'末端处的50bp侧翼，所述50bp侧翼与基因组DNA序列具有序列同一性以允许经由同源重组在期望的基因组基因座处进行整合。随后将包含引导RNA表达盒的功能性SGIC整合到S.cerevisiae基因组的INT1基因座中。作为sgRNA构建体或分裂SGIC的一部分的灰色框表示与INT1基因座的基因组DNA同源的序列。作为sgRNA构建体或分裂SGIC的一部分的黑色框代表接头序列(与S.cerevisiae基因组DNA没有同源性的50bpDNA序列)。4A：分裂SGIC；4B：具有分开的ssODN侧翼的SGIC；4C：具有附接的侧翼的SGICDNA。图5描绘了载体BG-AMA5的图谱，所述载体BG-AMA5表达经密码子对优化的Cas9以用于在A.niger中表达并用于实施例3中。载体及其构建的细节描述于WO2016110453A1中。图6描绘了载体BG-AMA9的图谱，所述载体BG-AMA9用于在A.niger中表达并用于实施例3中。载体及其构建的细节描述于WO2016110453A1中。图7描绘了在实施例3中使用的载体SGICDNAhygB的图谱。图8描绘了在实施例3中使用的载体SGICDNAphleo的图谱。图9描绘了实验3，所述实验3例示了使用SGIC来破坏A.niger中的fwnA6基因，如实施例3的描述中和表10至表15中进一步详述的。在图9A中，SGIC含有sgRNA盒，所述sgRNA盒靶向fwnA6基因座，并且通过瞬时表达并与Cas9一起作用而引入双链断裂，所述双链断裂由黑色三角形表示。5'和3'同源侧翼通过灰色方框1和2直观表示。SGIC称为‘SGIC片段I’，并通过同源重组整合到基因组中的fwnA6基因座处。在图9B中，SGIC含有：(1)sgRNA盒，所述sgRNA盒靶向fwnA6基因座，并且通过瞬时表达并与Cas9一起作用而引入双链断裂，所述双链断裂由黑色三角形表示，(2)标记盒，以及(3)5'和3'同源侧翼，所述5'和3'同源侧翼通过灰色方框1和2直观表示。SGIC称为‘SGIC片段IIA’或‘SGIC片段IIB’，并通过同源重组整合到基因组中的fwnA6基因座处。在图9C中，SGIC是包含两个2DNA片段的分裂SGIC，所述两个2DNA片段在Aspergillusniger中体内装配而形成功能性SGIC，所述功能性SGIC含有(1)sgRNA盒，所述sgRNA盒靶向fwnA6基因座，并且通过瞬时表达并与Cas9一起作用而引入双链断裂，所述双链断裂由黑色三角形表示，(2)标记盒，以及(3)5'和3'同源侧翼，所述5'和3'同源侧翼通过灰色方框1和2直观表示。所使用的分裂SGIC片段对于左侧DNA片段而言称为‘SGIC片段III’并且对于右侧DNA片段而言称为‘SGIC片段IVA’或‘SGIC片段IVB’；这些片段通过同源侧翼‘H’而在体内重组并形成功能性SGIC，所述功能性SGIC通过同源重组整合到基因组中的fwnA6基因座处。图10描绘了在实施例3中使用的载体BG-AMA14的图谱。图11描绘了在WO2016110453A1中描述并在实施例3中使用的载体BG-AMA8的图谱。图12例示了在实施例3中应用的多种实验方案，以显示SGIC在Aspergillusniger中的使用。图12A对应于表10和表11中的行A，图12B对应于表10和表11中的行B，并且对于图12C至图12G依此类推。图13描绘了在实施例3中使用的载体BG-AMA17的图谱。图14描绘了在实施例3中使用的载体BG-AMA1的图谱。图15A-L描绘了根据本专利技术的自引导整合构建体(SGIC)的可行和典型使用的多种方案，所述S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自引导整合构建体，其包含：/n-引导RNA表达盒，和/n-另外的多核苷酸元件，/n其中所述引导RNA表达盒能够表达功能性引导RNA或其部分，所述功能性引导RNA或其部分是对靶基因组中的靶序列特异的，其中包含所述引导RNA表达盒和所述另外的多核苷酸元件的所述自引导整合构建体的部分在其5'末端侧接第一多核苷酸并在其3'末端侧接第二多核苷酸，并且其中所述第一和第二多核苷酸与所述靶基因组中所述靶序列侧翼的序列具有序列同一性；前提条件是所述自引导整合构建体不包含编码多核苷酸引导的基因组编辑酶的表达构建体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170406 EP 17165201.91.一种自引导整合构建体，其包含：
-引导RNA表达盒，和
-另外的多核苷酸元件，
其中所述引导RNA表达盒能够表达功能性引导RNA或其部分，所述功能性引导RNA或其部分是对靶基因组中的靶序列特异的，其中包含所述引导RNA表达盒和所述另外的多核苷酸元件的所述自引导整合构建体的部分在其5'末端侧接第一多核苷酸并在其3'末端侧接第二多核苷酸，并且其中所述第一和第二多核苷酸与所述靶基因组中所述靶序列侧翼的序列具有序列同一性；前提条件是所述自引导整合构建体不包含编码多核苷酸引导的基因组编辑酶的表达构建体。


2.一种自引导整合构建体，其包含：
-引导RNA表达盒，和任选地，
-另外的多核苷酸元件，其中所述引导RNA表达盒能够表达功能性引导RNA或其部分，所述功能性引导RNA或其部分是对靶基因组中的靶序列特异的，其中包含所述引导RNA表达盒和任选地所述另外的多核苷酸元件的所述自引导整合构建体的部分在其5'末端侧接第一多核苷酸并在其3'末端侧接第二多核苷酸，其中所述第一和第二多核苷酸与所述靶基因组中所述靶序列侧翼的序列具有序列同一性，以及其中所述功能性引导RNA或其部分由所述引导RNA表达盒上的多核苷酸编码，并且所述多核苷酸可操作地连接至RNA聚合酶II启动子、至RNA聚合酶III启动子以及自加工核酶或至单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子；前提条件是所述自引导整合构建体不包含编码多核苷酸引导的基因组编辑酶的表达构建体。


3.一种自引导整合构建体，其包含：
两种或更多种多核苷酸，所述两种或更多种多核苷酸能够彼此重组以产生引导RNA表达盒，以及任选地另外的多核苷酸元件，
其中所述引导RNA表达盒能够表达功能性引导RNA或其部分，其中所述功能性引导RNA或其部分是对靶基因组中的靶序列特异的，其中包含所述引导RNA表达盒和任选地所述另外的多核苷酸元件的所述自引导整合构建体的部分在其5'末端侧接第一多核苷酸并在其3'末端侧接第二多核苷酸，并且其中所述第一和第二多核苷酸与所述靶基因组中所述靶序列侧翼的序列具有序列同一性；前提条件是所述自引导整合构建体不包含编码多核苷酸引导的基因组编辑酶的表达构建体。


4.根据实施方式1-3中任一项所述的自引导整合构建体，其中所述自引导整合构建体是线性的自引导整合构建体。


5.一种组合物，所述组合物包含两种或更多种多核苷酸构件，其中这些构件彼此具有序列同一性以允许它们在体内重组，诸如在宿主细胞中重组，以产生根据实施方式1或2所述的单个自引导整合构建体或以产生根据实施方式4所述的线性自引导整合构建体。


6.根据实施方式1-4所述的自引导整合构建体或根据实施方式5所述的组合物，其中所述另外的多核苷酸元件是控制序列、标记、目的基因、或破坏构建体。


7.一种包含实施方式1-4中任一项所定义的自引导整合构建体的组合物，或根据实施方式5所述的组合物，其优选包含自引导整合构建体文库，所述组合物优选地还包含功能性多核苷酸引导的基因组编辑酶或能够表达功能性多核苷酸引导的基因组编辑酶的表达构建体。


8.一种宿主细胞，其包含实施方式1-4或6中任一项所定义的自引导整合构建体或根据实施方式5所述的组合物。


9.根据实施方式8所述的宿主细胞，其还包含功能性多核苷酸引导的基因组编辑酶，优选地功能性多核苷酸引导的异源基因组编辑酶，或者还包含表达构建体，所述表达构建体能够表达功能性多核苷酸引导的基因组编辑酶，优选功能性多核苷酸引导的异源基因组编辑酶。


10.根据实施方式8或9所述的宿主细胞，其中所述自引导整合构建体整合到所述基因组中所述第一和第二多核苷酸与所述靶基因组中所述靶序列侧翼的序列具有序列同一性的位点处。


11.包含引导RNA表达盒的自引导整合构建体的离体用途，其中所述引导RNA表达盒能够表达功能性引导RNA或其部分，所述功能性引导RNA或其部分是对靶基因组中的靶序列特异的，其中包含所述引导RNA表达盒的所述自引导整合构建体的部分在其5'末端侧接第一多核苷酸并在其3'末端侧接第二多核苷酸，其中所述第一和第二多核苷酸与所述靶基因组中所述靶序列侧翼的序列具有序列同一性，以在宿主细胞中表达对靶基因组中的靶序列特异的功能性引导RNA或其部分，其中对靶基因组中的靶序列特异的所述功能性引导RNA或其部分仅从所述自引导整合构建体表达；前提条件是所述自引导整合构建体不包含编码多核苷酸引导的基因组编辑酶的表达构建体。


12.包含两种或更多种多核苷酸构件的组合物的离体用途，其中这些构件彼此具有序列同一性以允许它们在体内重组，诸如在宿主细胞中重组，以产生包含引导RNA表达盒的自引导整合构建体，其中所述引导RNA表达盒能够表达功能性引导RNA或其部分，所述功能性引导RNA或其部分是对靶基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰尼斯·安德列什·劳博斯，瑞内·维尔瓦尔，比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森，布伦达·沃恩克，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL