A fluorescent resonance energy transfer (FRET) construct comprising a donor and a receptor fluorophore portion, and a peptide connecting the two, which is a substrate of an endopeptidase fibroblast activating protein (FAP). A separate nucleic acid expressing the construct, a cell line containing the nucleic acid and a kit containing the construct are also provided. A method for detecting FAP by using the construct through FRET is further provided.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】成纤维细胞活化蛋白(FAP)识别的底物及其使用方法
技术介绍
人成纤维细胞活化蛋白(FAP；GenBank登录号AAC51668；EC3.4.21.B28)，也称为FAPα，seprase或循环抗纤溶酶切割酶(circulatingantiplasmin-cleavingenzyme)，是170kDa，II型跨膜丝氨酸蛋白酶和脯氨酸特异性蛋白酶的S9家族的成员，脯氨酸特异性蛋白酶的S9家族包括二肽基肽酶IV(DPPIV)、DPP8、DPP9、脯氨酰内肽酶(PREP，也称为POP)。FAP是含有两个N-糖基化亚基的同型二聚体，具有大的C-末端细胞外结构域，其中酶的催化结构域位于其中。在其糖基化形式中，FAP具有后脯氨酰二肽基肽酶和后脯氨酰内肽酶活性。人FAP最初在培养的成纤维细胞中被鉴定，并且在包括小鼠的几个物种中发现了该蛋白质的同源物。尽管进行了深入的研究，但FAP的生理学底物的身份仍然难以捉摸。FAP与其最接近的亲属DPPIV一样，表现出二肽基肽酶活性，在从各种分泌蛋白和肽激素中N末端的第二个位置存在的脯氨酸后切割。此外，FAP，但不是DPPIV，具有内肽酶活性，优先将羧基末端切割成Gly-Pro序列。虽然胶原蛋白具有重复的Gly-Pro基序，但除非是以变性或部分加工的形式(例如明胶)，否则它们对FAP的降解具有抗性。与FAP在调节胶原蛋白周转中的作用一致，FapKO小鼠在致病条件下显示升高的胶原蛋白水平。还提出FAP在α2-抗纤溶酶(α2AP)的N-末端附近的特定位点切割以增强其活性。另外，本专利技术人发现FAP在C-末端附近的特定位...
【技术保护点】
1.分子荧光共振能量转移(FRET)构建体，其包含接头肽、供体荧光团部分和受体荧光团部分，其中所述接头肽是成纤维细胞活化蛋白(FAP)内肽酶的底物。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
【国外来华专利技术】20170404 US 62/481,5391.分子荧光共振能量转移(FRET)构建体，其包含接头肽、供体荧光团部分和受体荧光团部分，其中所述接头肽是成纤维细胞活化蛋白(FAP)内肽酶的底物。
2.权利要求1所述的分子构建体，其中所述接头肽不是人S9肽酶的底物。
3.权利要求1所述的分子构建体，其中所述接头肽不是人S28肽酶的底物。
4.权利要求1所述的分子构建体，其中所述接头肽不是二肽基肽酶IV(DPPIV)、DPP8或DPP9中任一种的底物。
5.根据权利要求1所述的分子构建体，其中所述接头肽不是脯氨酰内肽酶(PREP)的底物。
6.权利要求1所述的分子构建体，其中所述接头肽将所述供体和受体荧光团分开不超过10nm的距离，并且其中所述供体荧光团部分的吸收光谱与所述受体荧光团部分的激发光谱重叠。
7.权利要求1所述的分子构建体，其中所述接头肽是包含以下序列的肽：
P3
P2
P1
P1’
P2’
P3’
Xaa1-
Xaa2-
Xaa3-
Xaa4-
Xaa5-
Xaa6-
(SEQIDNO:1)
其中Xaa1是：天然或非天然氨基酸残基或衍生物；
其中Xaa2是：选自天然存在的氨基酸或氨基酸类似物的D-对映体的残基；
其中Xaa3是：脯氨酸(Pro)或其衍生物；
其中Xaa4是：天然或非天然氨基酸残基或衍生物；
其中Xaa5是：天然或非天然氨基酸残基或衍生物；和，
其中Xaa6是：天然或非天然氨基酸残基或衍生物。
8.权利要求7所述的分子构建体，其中
Xaa2选自D-丙氨酸，D-丝氨酸和D-苏氨酸。
9.权利要求7所述的分子构建体，其中
Xaa2是具有式-NH-(CH2)n-COO-的氨基酸类似物，其中n＝2-10。
10.权利要求9所述的分子构建体，其中
Xaa2是选自β-丙氨酸(bAla)、γ-氨基丁酸(4Abu)、5-氨基戊酸和6-氨基己酸的氨基酸类似物。
11.权利要求7所述的分子构建体，其中
Xaa3是卤化脯氨酸残基。
12.权利要求11所述的分子构建体，其中
Xaa3是氟化脯氨酸残基。
13.权利要求7所述的分子构建体，其中
Xaa3是选自脱氢脯氨酸、4,4-二氟脯氨酸、3-氟脯氨酸、4-氟脯氨酸、3-羟基脯氨酸(3Hyp)和4-羟基脯氨酸(4Hyp)的脯氨酸衍生物。
14.权利要求7的分子构建体，其中Xaa1与所述供体荧光团部分或所述受体荧光团部分共价连接。
15.权利要求7的分子构建体，其中Xaa6与所述供体荧光团部分或受体荧光团部分共价连接。
16.权利要求7的分子构建体，其中所述供体荧光团部分和所述受体荧光团部分中的至少一个通过接头与接头肽共价连接。
17.权利要求16所述的分子构建体，其中所述接头包含选自赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)的至少一种氨基酸。
18.权利要求16所述的分子构建体，其中所述接头是赖氨酸(Lys)残基。
19.权利要求7的分子构建体，其中所述供体荧光团部分和所述受体荧光团部分中的至少一个与所述肽的氨基末端连接。
20.权利要求19的分子构建体，其中所述供体荧光团部分和所述受体荧光团部分中的至少一个与所述肽的羧基末端连接。
21.权利要求19的分子构建体，其中所述供体荧光团部分与所述肽的羧基末端连接，且所述受体荧光团部分与所述肽的氨基末端连接。
22.权利要求19的分子构建体，其中所述供体荧光团部分与所述肽的氨基末端连接，且所述受体荧光团部分与所述肽的羧基末端连接。
23.权利要求7的分子构建体，其中所述肽包含或组成为具有序列Val-(D-Ala)-Pro-Ser-Gln-Gly(SEQIDNO:2)的肽。
24.权利要求23所述的分子构建体，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的肽，并且其中所述肽是FAP的底物但不是人S9或S28肽酶的底物。
25.权利要求23所述的分子构建体，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的肽，并且其中所述肽是FAP的底物但不是人S9或S28肽酶的底物。
26.权利要求23所述的分子构建体，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比具有1至3个保守氨基酸置换的肽，其中所述肽是FAP的底物但不是人S9或S28肽酶的底物。
27.权利要求23所述的分子构建体，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比具有1个保守氨基酸置换的肽，其中所述肽是FAP的底物但不是人S9或S28肽酶的底物。
28.权利要求7所述的分子构建体，其中所述肽包含选自磷酸化和糖基化的修饰。
29.权利要求7所述的分子构建体，其中所述肽与聚乙二醇(PEG)分子连接。
30.权利要求29所述的分子构建体，其中PEG分子中的乙二醇(EG)单元的数量在75至2000之间。
31.根据权利要求7所述的分子构建体，其中所述肽与人IgG分子的Fc区的一个或多个结构域连接。
32.权利要求31所述的分子构建体，其中所述Fc区是人IgG铰链、CH2和CH3区，其与所述肽的氨基末端或羧基末端的至少一个融合。
33.权利要求7所述的分子构建体，其中所述肽与包含6至50个氨基酸残基的表位标签多肽连接。
34.权利要求7的分子构建体，其与固相支持体连接。
35.权利要求34所述的分子构建体，其中所述固相支持体包括玻璃、多糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮中的至少一种。
36.一种核酸分子，其编码权利要求1-27中所述的肽的至少一种。
37.表达载体，其包含权利要求36所述的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至控制序列用于权利要求1-27中任一项所述的肽的表达。
38.宿主细胞，其包含权利要求37的表达载体。
39.一种组合物，其包含权利要求1-35中任一项所述的分子构建体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
40.测定样品中成纤维细胞活化蛋白(FAP)酶活性的方法，其包括：
a)从哺乳动物受试者获得生物样品；
b)通过使所述样品的至少一部分与权利要求1-35中任一项所述的分子构建体接触，照射所述样品，并检测由所述肽酶指示构建体的FAP切割而产生的荧光，来检测所述样品中是否存在FAP酶活性；和
c)通过比较由所述分子构建体的FAP切割而产生的荧光与荧光和FAP酶活性的参考相关性来测定所述样品中的FAP酶活性。
41.权利要求40所述的方法，其中所述生物样品是全血、血清、血浆、滑液、细胞或组织或其裂解物、细胞培养上清液或包含重组FAP蛋白的样品。
技术研发人员：特拉维斯·威廉·班布里奇，詹姆斯·安德鲁·厄恩斯特，园田纯一郎，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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