人参肽和人参肽类似肽的制备和利用制造技术

本发明专利技术涉及固相肽合成或重组生产人参肽或人参肽类似肽或其盐的方法。还提供了人参肽或人参肽类似肽或其盐作为α1‑肾上腺素能受体拮抗剂和血管舒张剂、一氧化氮促进剂、抗血栓形成剂、抗动脉粥样硬化剂，作为抗多柔比星诱导的心脏毒性的保护剂、抗衰老和生理调节剂、营养食品、保健品或化妆品成分的用途。

Preparation and utilization of ginseng peptide and ginseng peptide like peptide

The invention relates to a method for synthesizing or recombining solid-phase peptide to produce ginseng peptide or ginseng peptide similar peptide or salt thereof. It also provides the use of ginseng peptide or ginseng peptide similar peptide or its salt as \u03b1 1 \u2011 adrenergic receptor antagonist and vasodilator, nitric oxide promoter, antithrombotic agent, antiatherosclerotic agent, as protective agent against doxorubicin induced cardiotoxicity, anti-aging and physiological regulator, nutritional food, health care product or cosmetic ingredient.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人参肽和人参肽类似肽的制备和利用相关申请的交叉引用本申请引用并要求2016年11月09日提交的新加坡专利申请号10201609388X的优先权权益，其内容通过引用并入本文中用于所有目的，包括依据PCT实施细则4.18条中未包含在本文说明书、权利要求或附图且涉及PCT实施细则20.5(a)条的任意要素或部分的并入。
本专利技术一般涉及固相肽合成或重组生成具有天然二硫键人参肽或人参肽类似肽或其盐的方法，以及制备的人参肽或人参肽类似肽或其盐的用途。
技术介绍
人参是一种传统的草药，已经使用了数千年。它是最广泛使用以及最有价值的药用植物之一。基于人参特别长且广泛的用途，人参已证明是普遍安全的。植物肽和蛋白质作为药用植物的生物活性成分，一直未被充分开发。人参肽(ginsentide)是人参中一类富含半胱氨酸的肽，可作为生物活性肽和药物发现的先导。然而，从植物中分离人参肽通常是费力且昂贵的。因此，本领域需要制备人参肽的方法。
技术实现思路
本专利技术通过提供制备人参肽或人参肽类似肽的合成和重组方法及其用途以满足本领域的上述需要。在第一方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐的固相肽合成方法，所述方法包括以下步骤：(a)以线性C-端至N-端方式，将Fmoc(芴甲氧羰基)保护的、可选地进一步合适的侧链保护的氨基酸、二肽和/或寡肽通过逐步偶联在固体载体上合成所述人参肽或人参肽类似肽，其中通过Fmoc-(Dmb)Gly-OH介导，在对应于SEQIDNO：1的24位的位置加入甘氨酸残基；(b)从所述固体载体上切割所述人参肽或人参肽类似肽并去保护肽；以及随后，(c)所述人参肽或所述人参肽类似肽进行有机氧化折叠以形成天然二硫化物连接。在多个实施方式中，步骤(a)包括以下步骤：(i)通过从第一氨基酸中去除保护性化学基团，使与所述固体载体连接的所述第一氨基酸去保护；(ii)活化第二氨基酸上的化学基团，制备与所述第一氨基酸偶联的所述第二氨基酸；(iii)将活化的所述第二氨基酸与去保护的所述第一氨基酸偶联，形成由所述第一和所述第二氨基酸组成的肽；以及(iv)连续去保护，并将多个氨基酸偶联到生长的肽链中，直至合成所述人参肽或人参肽类似肽。在多个实施方式中，所述方法包括通过施加微波能量促进所述去保护、所述活化和所述偶联步骤中的至少一个。在多个实施方式中，所述有机氧化折叠在非水条件下进行，并在有机溶剂中进行。在多个实施方式中，所述有机氧化折叠包括将所述人参肽或人参肽类似肽在包含半胱胺和/或吗啉的有机溶剂中折叠，优选为二甲基亚砜(DMSO)和/或异丙醇。在多个实施方式中，所述有机氧化折叠在4℃进行。在多个实施方式中，所述方法包括纯化折叠的所述人参肽或人参肽类似肽或其盐，优选为通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)。在第二方面，本专利技术涉及重组制备人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽包含具有SEQIDNO：65所示的氨基酸序列的麦芽糖结合蛋白、具有SEQIDNO：66所示的氨基酸序列的肠激酶切割序列，以及所述人参肽或人参肽类似肽或其盐；(b)在允许表达所述多肽的条件下，在生长培养基中培养所述宿主细胞，并从所述培养基中回收所述多肽；以及(c)通过使用肠激酶切割所述多肽，生成所述人参肽或人参肽类似肽或其盐。在多个实施方式中，所述多肽具有SEQIDNO：67-80中任一个所示的氨基酸序列。在多个实施方式中，所述方法还包括在所述肠激酶切割之前，纯化重组产生的所述多肽，优选为通过直链淀粉树脂纯化。在多个实施方式中，所述方法还包括在所述肠激酶切割后，通过阴离子交换层析和/或反相层析纯化所述人参肽或人参肽类似肽或其盐。在第三方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为α1-肾上腺素能受体拮抗剂和血管舒张剂的用途。在第四方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为一氧化氮促进剂的用途。在第五方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为抗血栓形成剂的用途。在第六方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为抗动脉粥样硬化剂的用途。在第七方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为抗多柔比星(DOX)诱导的心脏毒性的保护剂的用途。在第八方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为抗衰老和生理调节剂的用途。在第九方面，本专利技术涉及人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐或通过色谱、尺寸排阻或纯化相关的方法从人参植物或含有人参肽或人参肽类似肽的植物中获得的富集级分作为营养食品、保健品或化妆品成分的用途。根据本专利技术的上述所有方面，所述人参肽或所述人参肽类似肽具有(i)SEQIDNO：1-64中任一个所示的氨基酸序列；或(ii)在与(i)肽的整个序列有至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％或74％，优选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％或84％，甚至更优选地至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％，最优选地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。附图说明参考结合非限制性实施例和附图的详细描述，可以更好地理解本专利技术。图1.人参肽的生理调节效果示意图。TP1：SEQIDNO：1。图2.化学合成人参肽的示意流程图。图3.合成人参肽TP1的氧化折叠策略。图4.使用UHPLC和MALDI-MS比较天然的和合成的人参肽TP1。图5.使用1D和2DNMR比较天然的和合成的人参肽TP1。图6.天然的和合成的人参肽TP1在一氧化氮产量的功能比较。图7.人参肽重组表达方案。肽段DDDDK：SEQIDNO:66。图8.IPTG诱导麦芽糖结合蛋白-TP1融合蛋白表达。图9.直链淀粉柱纯化麦芽糖结合蛋白-TP1融合蛋白。S-细胞裂解物；FT-柱流出物；W1-第一次洗涤；W2-第二次洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐的固相肽合成的方法，所述人参肽或人参肽类似肽具有(i)SEQ ID NO:1-64中任一个所示的氨基酸序列；或(ii)与(i)肽的整个序列有至少65％，优选地至少75％，甚至更优选地至少85％，最优选地至少95％的序列一致性的氨基酸序列，其中所述方法包括以下步骤：/n(a)以线性C-端至N-端方式，将Fmoc保护的、可选地进一步合适的侧链保护的氨基酸、二肽和/或寡肽通过逐步偶联在固体载体上合成所述人参肽或人参肽类似肽，其中通过Fmoc-(Dmb)Gly-OH介导，在对应于SEQ ID NO：1的24位的位置加入甘氨酸残基；/n(b)从所述固体载体上切割所述人参肽或人参肽类似肽并去保护肽；以及随后，/n(c)所述人参肽或人参肽类似肽进行有机氧化折叠以形成天然二硫化物连接。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161109 SG 10201609388X1.人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐的固相肽合成的方法，所述人参肽或人参肽类似肽具有(i)SEQIDNO:1-64中任一个所示的氨基酸序列；或(ii)与(i)肽的整个序列有至少65％，优选地至少75％，甚至更优选地至少85％，最优选地至少95％的序列一致性的氨基酸序列，其中所述方法包括以下步骤：
(a)以线性C-端至N-端方式，将Fmoc保护的、可选地进一步合适的侧链保护的氨基酸、二肽和/或寡肽通过逐步偶联在固体载体上合成所述人参肽或人参肽类似肽，其中通过Fmoc-(Dmb)Gly-OH介导，在对应于SEQIDNO：1的24位的位置加入甘氨酸残基；
(b)从所述固体载体上切割所述人参肽或人参肽类似肽并去保护肽；以及随后，
(c)所述人参肽或人参肽类似肽进行有机氧化折叠以形成天然二硫化物连接。


2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括以下步骤：
(i)通过从第一氨基酸中去除保护性化学基团，使与所述固体载体连接的所述第一氨基酸去保护；
(ii)活化第二氨基酸上的化学基团，制备与所述第一氨基酸偶联的所述第二氨基酸；
(iii)将活化的所述第二氨基酸与去保护的所述第一氨基酸偶联，形成由所述第一和所述第二氨基酸组成的肽；以及
(iv)连续去保护，并将多个氨基酸偶联到生长的肽链中，直至合成所述人参肽或人参肽类似肽。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括通过施加微波能量促进所述去保护、所述活化和所述偶联步骤中的至少一个。


4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述有机氧化折叠在非水条件下进行，并在有机溶剂中进行。


5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述有机氧化折叠包括将所述人参肽或人参肽类似肽在包含半胱胺和/或吗啉的有机溶剂中折叠，优选为二甲基亚砜和/或异丙醇。


6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述有机氧化折叠在4℃进行。


7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述方法包括纯化折叠的所述人参肽或人参肽类似肽或其盐，优选为通过反相高效液相色谱。


8.重组制备人参肽或人参肽类似肽或其药学上可接受的盐的方法，所述人参肽或人参肽类似肽具有(i)SEQIDNO:1-64中任一个所示的氨基酸序列；或(ii)与(i)肽的整个序列有至少65％，优选地至少75％，甚至更优选地至少85％，最优选地至少95％的序列一致性的氨基酸序列，其中所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽包含具有SEQIDNO：65所示的氨基酸序列的麦芽糖结合蛋白、具有SEQIDNO：66所示的氨基酸序列的肠激酶切割序列，以及所述人参肽或人参肽类似肽或其盐；
(b)在允许表达所述多肽的条件下，在生长培养基中培养所述宿主细胞，并从所述培养基中回收所述多肽；以及
(c)通过使用肠激酶切割所述多肽，生成所述人参肽或人参肽类似肽或其盐。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述多肽具有SEQIDNO：67-80中任一个所示的氨基酸序列。


10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述方法还包括在所述肠激酶切割之前，纯化重组产生的所述多肽，优选为通过直链淀粉树脂纯化。


11.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·P·谈，
申请(专利权)人：南洋理工大学，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG