The invention relates to a new method for synthesizing polynucleotide molecules according to pre defined nucleotide sequences. The invention also relates to a method for assembling synthetic polynucleotides after synthesis, as well as a system and a kit for carrying out the synthesis and / or assembly method.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成多核苷酸分子的方法和试剂
本专利技术涉及根据预限定的核苷酸序列合成多核苷酸分子的新方法。本专利技术还涉及合成后组装合成多核苷酸的方法，以及用于进行合成和/或组装方法的系统和试剂盒。
技术介绍
目前存在两种用于合成和组装多核苷酸分子特别是DNA的主要方法。亚磷酰胺化学是一种合成方法，其通过逐步方法将化学活化的T、C、A或G的单体组装成长度约为100/150个碱基的寡核苷酸。化学反应步骤是高度敏感的，并且条件在完全无水(完全不存在水)、水性氧化和酸性条件之间交替(Roy和Caruthers，Molecules，2013，18，14268-14284)。如果来自先前反应步骤的试剂尚未完全除去，则这将对未来的合成步骤产生不利影响。因此，该合成方法限于产生长度约为100个核苷酸的多核苷酸。聚合酶合成方法使用聚合酶使用T、C、A和G三磷酸合成DNA模板的互补链。反应条件是含水的和温和的，并且该方法可用于合成长度为数千碱基的DNA多核苷酸。该方法的主要缺点是单链和双链DNA不能通过该方法从头合成，它需要从中制备拷贝的DNA模板。(Kosuri和Church，NatureMethods，2014，11，499-507)。因此，先前的方法不能用于在没有复制的预先存在的模板分子的帮助下从头合成双链DNA。本专利技术人开发了新的方法，通过该方法可以以逐步的方式从头合成单链和双链多核苷酸分子，而无需复制预先存在的模板分子。这些方法还避免了与亚磷酰胺化学技术相关的极端条件，相反，在中性pH附近的温和水性条件...
【技术保护点】
1.一种合成具有预定序列的双链多核苷酸的体外方法，所述方法包括进行合成循环，其中在每个循环中通过掺入预定序列的核苷酸延伸第一链，然后通过掺入核苷酸延伸与第一链杂交的第二链，从而与第一链的掺入的核苷酸形成核苷酸对。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170119 GB 1700937.41.一种合成具有预定序列的双链多核苷酸的体外方法，所述方法包括进行合成循环，其中在每个循环中通过掺入预定序列的核苷酸延伸第一链，然后通过掺入核苷酸延伸与第一链杂交的第二链，从而与第一链的掺入的核苷酸形成核苷酸对。
2.根据权利要求1所述的方法，其中每个循环包括通过将预定序列的核苷酸与连接的可逆封闭基团结合，然后延伸第二链来延伸第一链，其中在第二链延伸之前或之后除去可逆封闭基团。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在每个循环中，将核苷酸掺入支架多核苷酸中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中每个循环包括：
(1)提供支架多核苷酸；
(2)通过聚合酶的作用将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸，所述核苷酸包括通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(3)在切割位点切割所述支架多核苷酸；
(4)将连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含预定序列的核苷酸的配偶体核苷酸，其中在连接时，预定序列的核苷酸与配偶体核苷酸配对；和
(5)从预定序列的核苷酸中去除所述可逆终止子基团。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(1)包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分，并且所述支持链包含通用核苷酸；其中步骤(3)包括在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸；并且其中在步骤(4)中，连接多核苷酸包含支持链，所述支持链包含通用核苷酸，所述通用核苷酸限定用于下一循环的切割位点，并且其中所述连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的支持链。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，所述方法包括：
(1)提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含通过单链断裂分开的引物链部分和辅助链部分，并且所述支持链包含通用核苷酸；
(2)通过聚合酶的作用掺入所述预定序列的第一核苷酸到合成链中，第一核苷酸包含通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(3)在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供包含第一核苷酸的突出末端；
(4)将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含支持链、辅助链和互补连接末端，所述连接末端包含在支持链中的通用核苷酸和突出了辅助链的第一核苷酸的配偶体核苷酸，以及在辅助链中的缺少磷酸基团的末端核苷酸，其中在连接支持链时，第一核苷酸与配偶体核苷酸配对，
(5)从第一核苷酸中除去终止子基团；
(6)通过聚合酶的作用将预定的核苷酸序列的下一个核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链中，所述下一个核苷酸包含通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(7)在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供包含所述下一个核苷酸的突出末端；
(8)将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含支持链、辅助链和互补连接末端，所述连接末端包含在支持链中的通用核苷酸和突出了辅助链的下一个核苷酸的配偶体核苷酸，以及在辅助链中的缺少磷酸基团的末端核苷酸，其中在连接支持链时，所述下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
(9)从所述下一个核苷酸中去除终止子基团；和
(10)多次重复步骤6至9以提供具有预定核苷酸序列的双链多核苷酸。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在给定合成循环中，通用核苷酸占据以下中的位置n：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中相对于通用核苷酸在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上占据的位置的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n和n-1之间切割。
8.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在给定合成循环中，通用核苷酸占据以下中的位置n+1：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中相对于在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上的位置n的下一个核苷酸位置，并且其中位置n+1是支持链中相对于在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上的位置n的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n和n-1之间切割。
9.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在给定合成循环中，通用核苷酸占据以下中的位置n：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中的相对于在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上被通用核苷酸占据的位置的下一个核苷酸位置，并且其中位置n-2是支持链中在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上相对于位置n-1的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n-1和n-2之间切割。
10.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中:
a)在步骤(1)/(6)中，支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂相邻的辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对(位置n)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的通用核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与通用核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在通用核苷酸位置(位置n)和支持链中通用核苷酸位置旁边的核苷酸(在辅助链的远端/接近引物链的方向上位置n-1)之间的位置处切割，其中切割在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，所述支架多核苷酸包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；和
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的连接末端包含单核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链的末端核苷酸相对的(位置n)并与其配对；
ii.通用核苷酸位于支持链的末端核苷酸旁边；
iii.支持链的末端核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)/(6)的第一/下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
11.根据权利要求6或权利要求8所述的方法，其中:
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸(位置n)是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并且支持链中的通用核苷酸位于配偶体核苷酸旁边(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上的位置n+1)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第一核苷酸(位置n)和第二核苷酸(位置n-1)之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含单核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于辅助链的倒数第二个核苷酸(位置n+1)的对面，并与其配对；
ii.所述通用核苷酸位于支持链的倒数第二个核苷酸旁边(位置n)；
iii.支持链的倒数第二个核苷酸(位置n)与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸；和
iv.支持链的末端核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸。
12.根据权利要求6或权利要求9所述的方法，其中:
a)在步骤(1)/(6)中，支架多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂相邻的辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对(位置n)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的通用核苷酸相对的位置掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与通用核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第一核苷酸(位置n-1)和第二核苷酸(位置n-2)之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生双核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含双核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链的末端核苷酸相对的(位置n)并与其配对；
ii.所述通用核苷酸位于支持链的倒数第二个核苷酸旁边；和
iii.支持链的倒数第二个核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)/(6)中第一/下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与预定序列的第一个/下一个核苷酸配对的核苷酸是与第一个/下一个核苷酸互补的核苷酸，优选天然互补的核苷酸。
14.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中步骤(1)和/或(6)包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，所述合成链没有辅助链。
15.根据权利要求6至14中任一项所述的方法，其中在任何一个或多个合成循环中，或在所有合成循环中，在将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的步骤之后和在将预定核苷酸序列的核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链的步骤之前，从支架多核苷酸中除去合成链的辅助链部分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述合成链的辅助链部分通过以下方式从支架多核苷酸中除去：(i)将支架多核苷酸加热至约80℃至约95℃的温度并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(ii)用尿素溶液(例如8M尿素)处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(iii)用甲酰胺或甲酰胺溶液(例如100％甲酰胺)处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，或(iv)使支架多核苷酸与单链多核苷酸分子接触，所述单链多核苷酸分子包含与辅助链部分的序列互补的核苷酸序列区域，从而竞争性地抑制辅助链部分与支架多核苷酸的杂交。
17.根据权利要求4至7、权利要求10和权利要求13至16中任一项所述的方法，其中每个切割步骤包括第一步，其包括去除通用核苷酸，从而形成无碱基位点，和第二步，其包括在所述无碱基位点切割支持链。
18.根据权利要求17所述的方法，其中第一步用核苷酸切除酶进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述核苷酸切除酶是3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·米尔顿，索比亚·纳亚，简·里德尔，大柿亮祐，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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