视网膜劈裂的非人类动物模型制造技术

本发明专利技术提供了适合用作针对视网膜劈裂的动物模型的非人类动物。在一些实施方案中，所提供的非人类动物的特征在于视网膜劈裂蛋白‑1基因座中的断裂。在一些实施方案中，所提供的非人类动物的特征在于突变型视网膜劈裂蛋白‑1基因。在一些实施方案中，所述非人类动物可以描述为具有这样的表型：所述表型包括产生与视网膜劈裂相关的一种或多种症状或表型。本发明专利技术还提供了鉴定可以用于预防、延缓或治疗视网膜劈裂或眼部相关的疾病、障碍或病症的治疗候选物的方法。

A non-human animal model of retinoschisis

The invention provides a non-human animal suitable for use as an animal model for retinal cleavage. In some embodiments, the provided non-human animal is characterized by a break in the cleavage protein-1 locus of the retina. In some embodiments, the non-human animal provided is characterized by a mutant retinoschisin-1 gene. In some embodiments, the non-human animal may be described as having a phenotype that includes the production of one or more symptoms or phenotypes related to retinoschisis. The invention also provides methods for identifying treatment candidates that can be used to prevent, delay or treat retinoschisis or eye related diseases, disorders or disorders.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】视网膜劈裂的非人类动物模型相关专利申请的交叉引用本专利申请要求2017年2月27日提交的美国临时申请No.62/463,872和2017年10月24日提交的美国临时申请No.62/576,256的优先权权益，这两个临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。序列表以引用的方式并入序列表为2018年2月5日产生的名称为35518_10328WO01_SequenceListing.txt、大小为117KB的ASCII文本文件，其经由EFS-Web提交给美国专利及商标局，并且以引用的方式并入本文。
技术介绍
世界卫生组织(WHO)估计，全世界约有1.8亿人视力残疾，其中近600万人的视力残疾是儿童失明的所有原因(Blindness:Vision2020,TheGlobalInitiativefortheEliminationofAvoidableBlindness,资料概览No.213,TheWorldHealthOrganization,2000年修订)。视网膜劈裂蛋白-1(Retinoschisin-1)(Rs1)基因中的突变导致的X连锁青少年视网膜劈裂(XLRS)是在男性儿童中发生的早发性黄斑变性，其特征在于视网膜内层的劈裂，所述劈裂会导致严重的视力丧失。目前的治疗选择仅限于低视力助视器，诸如光学装置(例如，放大镜)、非光学装置(例如，作业照明、阅读架等)和电子装置。
技术实现思路
本公开涵盖以下认知：希望对非人类动物进行工程化改造，以提供改进的体内系统，所述改进的体内系统用于鉴定和开发可用于治疗和/或预防视网膜劈裂(例如，X连锁视网膜劈裂)的新疗法以及在一些实施方案中治疗方案。在一些实施方案中，本文所述的体内系统可用于鉴定和开发用于治疗眼部相关疾病、障碍和/或病症的新疗法。在一些实施方案中，所提供的体内系统还可用于鉴定和开发用于治疗与视力丧失相关的疾病、障碍和/或病症的新疗法。在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Rs1基因和/或其他功能上沉默的Rs1基因中的断裂，以使得主体RS1多肽不表达或产生，并且将所述非人类动物例如用于鉴定和开发恢复和/或改善视网膜结构和/或功能的疗法是所期望的。还提供了包含经工程化的变体或突变型Rs1基因，以使得变体或突变型RS1多肽从所述经工程化的变体或突变型Rs1基因产生的非人类动物，并且将所述非人类动物例如用于鉴定和开发恢复和/或改善视网膜结构和/或功能的疗法是所期望的。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了针对视网膜劈裂的改进的体内系统(或模型)。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了针对眼部相关疾病、障碍和/或病症的改进的体内系统(或模型)。在一些实施方案中，提供了期望用作针对视网膜劈裂的动物模型的非人类动物。在多个实施方案中，所提供的非人类动物的特征在于Rs1基因中的断裂(例如，全部或部分编码区缺失)或突变(例如，编码序列中的一个或多个点突变)。在一些实施方案中，Rs1基因中的断裂或突变会影响包含所述断裂或突变的非人类动物的一个或多个视网膜。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的Rs1基因中的断裂或突变会导致非人类动物中以下表型中的一者或多者的形成、发展或出现：视网膜劈裂样表型(例如，视网膜内层的劈裂、视网膜变性和视力下降)；黄斑或视网膜的劈裂；视力回退；视网膜纤维化；和视网膜色素沉着；并且在某些实施方案中，所述表型包括内层视网膜内的囊肿结构的发展，以及与野生型非人类动物相比ERGb-波和a-波反应的减少，其后是感光细胞的丧失。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的Rs1基因中的断裂或突变会导致非人类动物中的视网膜的早发性(例如，在或到出生后第15天、第18天、第21天、第24天或第27天)功能和形态表型。在一些实施方案中，视网膜的早发性功能缺陷可以通过与野生型非人类动物相比，(i)在暗适应和明适应ERG分析中相对于a-波的b-波的减少(产生负ERG)；(ii)ERGb-波的最大反应和灵敏度值的减小；(iii)ERGa-波的最大反应值的减小；或(iv)(i)-(iii)的组合来反映。在一些实施方案中，视网膜的早发性形态缺陷可以通过与野生型非人类动物相比的劈裂、椭圆体区(EZ)变宽、外层视网膜变薄或它们的组合来反映。在一些实施方案中，非人类Rs1基因中的断裂(例如，缺失)或突变是内源性Rs1基因座处的内源性Rs1基因的断裂或突变。在一些实施方案中，非人类Rs1基因中的断裂(例如，缺失)是核酸序列插入内源性Rs1基因座(在某些实施方案中，包含报告基因)处的内源性Rs1基因中的结果。在一些实施方案中，断裂为或包括内源性Rs1基因的全部或部分的缺失，所述缺失消除了基因产物(例如，mRNA或多肽)的表达或产生。在一些实施方案中，非人类Rs1基因中的突变(例如，点突变)是核酸序列插入内源性Rs1基因座(在某些实施方案中，包含合成外显子(例如，包含点突变的合成外显子))处的内源性Rs1基因中的结果。在一些实施方案中，突变为或包括引起变体RS1多肽的表达的Rs1基因中的一个或多个点突变，所述变体RS1多肽与野生型RS1多肽相比具有减少或改变的功能；在某些实施方案中，非人类动物中的变体RS1多肽的水平小于野生型非人类动物中的野生型RS1多肽的水平。在一些实施方案中，与野生型RS1多肽相比，如本文所述的变体RS1多肽包含一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所提供的非人类动物具有包含经工程化的Rs1基因的基因组。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因定位于内源性Rs1基因座；并且在其他实施方案中，经工程化的Rs1基因定位于不同的基因座。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因为或包括异源性Rs1基因(例如，人Rs1基因)。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码全部或部分异源性RS1多肽的遗传物质。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码异源性多肽的盘状结构域的遗传物质，与野生型或亲本异源性RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换。在一些实施方案中，与野生型或亲本Rs1基因(例如，内源性或同源基因)相比，经工程化的Rs1基因包含引起变体RS1多肽的表达的一个或多个突变。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码啮齿动物RS1多肽的盘状结构域的遗传物质，与野生型或亲本啮齿动物RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码异源性RS1多肽的盘状结构域的遗传物质，与野生型或亲本异源性RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换；例如，经工程化的Rs1基因包含编码人RS1多肽的盘状结构域的核苷酸序列，与野生型人RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换。在一些实施方案中，与野生型或亲本RS1多肽相比，由如本文所述的经工程化的Rs1基因编码的RS1多肽的盘状结构域包含一个或多个氨基酸置换。因此，在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的工程化Rs1基因编码特征在于包含氨基酸置换的盘状结构域的RS1多肽(例如，变体RS1多肽)。在一些实施方案中，提供了这样的非人类动物：在其基因组中包含内源性R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种啮齿动物，所述啮齿动物的基因组中包含内源性啮齿动物Rs1基因座处的内源性啮齿动物视网膜劈裂蛋白-1(Rs1)基因的编码序列的全部或部分的缺失。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170227 US 62/463,872;20171024 US 62/576,2561.一种啮齿动物，所述啮齿动物的基因组中包含内源性啮齿动物Rs1基因座处的内源性啮齿动物视网膜劈裂蛋白-1(Rs1)基因的编码序列的全部或部分的缺失。


2.如权利要求1所述的啮齿动物，其中所述缺失导致缺乏从所述Rs1基因座产生的功能性RS1多肽。


3.如权利要求1或权利要求2所述的啮齿动物，其中所述缺失是至少外显子2-3的缺失。


4.如权利要求1或权利要求2所述的啮齿动物，其中所述缺失是外显子1和外显子2-3的至少一部分的缺失。


5.如权利要求1至权利要求4中任一项所述的啮齿动物，其中所述Rs1基因座包含报告基因。


6.如权利要求5所述的啮齿动物，其中所述报吿基因可操作地连接至Rs1启动子。


7.如权利要求6所述的啮齿动物，其中所述Rs1启动子是内源性启动子。


8.如权利要求2所述的啮齿动物，其中所述Rs1基因座缺乏来自紧邻外显子1的ATG起始密码子的3'的编码部分，缺乏外显子2-3，并且包含框内融合至所述Rs1基因的所述起始(ATG)密码子的报告基因编码序列。


9.如权利要求5至权利要求8中任一项所述的啮齿动物，其中所述报告基因是lacZ或编码选自以下的蛋白质的基因：荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP。


10.如权利要求5至权利要求9中任一项所述的啮齿动物，其中所述报告基因的表达模式类似于野生型非人类动物中的内源性啮齿动物Rs1基因座处的野生型啮齿动物Rs1基因的表达模式。


11.如权利要求1所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雄性啮齿动物。


12.如权利要求1所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雌性啮齿动物。


13.如权利要求12所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述缺失是纯合的。


14.如权利要求12所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述缺失是杂合的。


15.一种啮齿动物，所述啮齿动物的基因组包含经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码与野生型RS1多肽相比具有至少一个氨基酸置换的RS1多肽。


16.如权利要求15所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是信号序列中的置换。


17.如权利要求16所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是疏水性残基被脯氨酸或者被亲水性残基或带电残基置换。


18.如权利要求15所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是RS1区或侧接盘状结构域的C-末端区段中的置换。


19.如权利要求18所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是选自位置38、40、59和223的位置处的半胱氨酸的置换。


20.如权利要求19所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是C59S置换。


21.如权利要求15所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是所述盘状结构域中的置换。


22.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是选自位置63、83、110、142和219的位置处的半胱氨酸的置换。


23.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是所述盘状结构域中的非半胱氨酸残基被半胱氨酸置换。


24.如权利要求23所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是R141C置换。


25.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是所述盘状结构域中的带电残基被不带电残基置换、不带电残基被带电残基置换或带电残基被带相反电荷的残基置换。


26.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是通过插入或除去脯氨酸而产生的所述盘状结构域中的置换。


27.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是通过插入或除去极性残基而产生的所述盘状结构域中的置换。


28.如权利要求15至权利要求27中任一项所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因还包含一个或多个选择性标记。


29.如权利要求15至权利要求27中任一项所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因还包含一个或多个位点特异性重组酶识别位点。


30.如权利要求29所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因还包含重组酶基因和侧接有所述一个或多个位点特异性重组酶识别位点的选择性标记，所述位点特异性重组酶识别位点被定向为引导切除。


31.如权利要求30所述的啮齿动物，其中所述重组酶基因可操作地连接至启动子，所述启动子驱动分化细胞中的所述重组酶基因的表达而不驱动未分化细胞中的所述重组酶基因的表达。


32.如权利要求20或权利要求21所述的啮齿动物，其中所述启动子为或包括SEQIDNO:30、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32。


33.如权利要求15至权利要求32中任一项所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因是在内源性啮齿动物Rs1基因座处。


34.如权利要求33所述的啮齿动物，其中所述点突变在所述内源性啮齿动物Rs1基因座处的所述内源性啮齿动物Rs1基因的外显子中。


35.如权利要求33至权利要求34中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雄性啮齿动物。


36.如权利要求33至权利要求34中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雌性啮齿动物。


37.如权利要求36所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述经工程化的Rs1基因是纯合的。


38.如权利要求36所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述经工程化的Rs1基因是杂合的。


39.一种啮齿动物，所述啮齿动物表达包含C59S或R141C置换的RS1多肽。


40.如前述权利要求中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物产生视网膜劈裂的一种或多种症状，任选地到出生后15天、18天、21天或24天产生所述症状。


41.如前述权利要求中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。


42.一种分离的啮齿动物细胞或组织，所述分离的啮齿动物细胞或组织的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码具有一个或多个氨基酸置换的RS1多肽。


43.一种永生化细胞，所述永生化细胞从如权利要求42所述的分离的啮齿动物细胞制备。


44.一种啮齿动物胚胎干(ES)细胞，所述啮齿动物胚胎干(ES)细胞的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码具有一个或多个氨基酸置换的RS1多肽。


45.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎从如权利要求44所述的胚胎干细胞产生。


46.一种试剂盒，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S布里奇斯，Y唐，Y刘，J曹，C罗马诺，
申请(专利权)人：再生元制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US