一种检测PS外泌体的生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种磷酯酰丝氨酸(PS)外泌体的生物传感器及其制备方法。本发明专利技术以PS特异性识别肽作为识别元件，识别肽组装的生物传感电极作为捕获基底，由g‑C

A biosensor for the detection of PS exosomes and its preparation

The invention provides a biosensor for phosphatidylserine (PS) exosomes and a preparation method thereof. In the invention, PS specific recognition peptide is used as recognition element, and the biosensor electrode assembled by recognition peptide is used as capture substrate, which is composed of G \u2011 C

【技术实现步骤摘要】
一种检测PS外泌体的生物传感器及其制备方法
本专利技术属于外泌体检测
，具体涉及一种基于识别肽检测肿瘤源外泌体的电致化学发光传感器及其制备方法。
技术介绍
癌症已成为威胁人类健康的头号杀手，其早期发现和准确检测对降低患者死亡率与提高存活率具有十分重要的现实意义。长期以来，肿瘤组织活检常作为肿瘤诊断的金标准，但随着对肿瘤研究的深入，科学家发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为肿瘤具有异质性，某些患者不适合做组织活检，组织活检的滞后性对患者的治疗不利。肿瘤标志物检测作为一种肿瘤诊断方法在临床中得到了广泛的应用，但临床常用的肿瘤标志物如，甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)等的灵敏度和早期检出率都满足不了临床早诊早治的需求。因此，对于癌症的诊断和检测技术提出了更高的要求。外泌体，纳米级双层膜性的细胞外囊泡，直径为30-150nm。外泌体所携带和传递母细胞的大量的信息分子，包括脂质，蛋白质和核酸等，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关，如肿瘤细胞分泌的外泌体可进入淋巴系统和肿瘤组织内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤发生和转移等过程的调控作用。因此，外泌体被认为是癌症早期诊断的新一代肿瘤标志物，开发用于高灵敏和高特异性检测肿瘤外泌体的分析技术十分重要。迄今为止，大多数检测肿瘤源外泌体用于癌症诊断的研究都集中在作为特定肿瘤类型替代标志物的外泌体蛋白质和核酸上。最新研究表明，健康人、良性肿瘤和恶性肿瘤患者之间血液中磷酯酰丝氨酸(PS)阳性的外泌体具有非常明显的差异，对血样中PS阳性肿瘤外泌体的定量评估可以在临床证据之前检测到非常早期的恶性肿瘤，证明血液中PS阳性肿瘤外泌体是一种泛癌早期诊断可靠的潜在标志物。因此实现对血样中PS阳性肿瘤外泌体的准确、高效检测，不仅可以大幅降低诊断成本、减少对患者的侵入性手术，对癌症的早期诊断和疗效评估也具有非常高的临床价值。目前，开发的用于PS外泌体检测的方法较少，主要包括蛋白印迹法、流式细胞术和酶联免疫吸附法。且这些方法具有一定的缺点，如仪器昂贵、操作复杂且耗时等。此外，上述PS外泌体检测方法中常用的抗原抗体免疫结合虽能取得较高的检测灵敏度，但是筛选特异性结合的抗体往往步骤复杂，但抗体使用时特异性位点结合困难，一方面，蛋白质识别元件(抗体、受体蛋白等)的合成和纯化过程繁琐复杂，在各种检测条件下或长期储存时缺乏稳定性，易受pH、温度等环境因素影响而变性，且价格较昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测PS阳性肿瘤源外泌体生物传感器及制备方法，通过识别肽基探针对PS阳性外泌体的高特异性结合，实现对样品中的PS阳性外泌体进行快速、高灵敏检测，解决现有外泌体检测中操作复杂，灵敏度低，常用的识别元件(抗体、核酸适配体等)合成和纯化过程繁琐复杂，在各种检测条件下或长期储存时缺乏稳定性，易受pH、温度等环境因素影响而变性，价格昂贵等问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种检测磷酯酰丝氨酸PS阳性外泌体的生物传感器，该传感器以PS特异性识别肽作为识别元件，识别肽组装的生物传感电极作为捕获基底，由g-C3N4纳米片、鲁米诺-AuNPs和识别肽组成的电致化学发光探针作为信号探针。一种PS特异性识别肽，其氨基酸序列为FNFRLKAGAKIRFGRGC，序列中下划线部分为PS特异性识别序列，RGC为键连序列，末端半胱氨酸C中的巯基可以与金结合。所述捕获基底的制备方法，包括以下步骤：以氯金酸溶液为电沉积底液，玻碳电极为工作电极，采用恒电位沉积方法，制备出AuNPs修饰的玻碳电极，进一步用去离子水冲洗、室温晾干后，将修饰电极浸入识别肽溶液中进行孵育并冲洗；随后再将修饰电极浸入牛血清蛋白中进行封闭，得到识别肽组装的生物传感电极。所述信号探针的制备方法，包括以下步骤：将g-C3N4纳米片和鲁米诺-AuNPs混合均匀后，搅拌，然后以6000rpm离心30分钟除去上清得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物，将得到的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物与识别肽通过巯基与金配位作用形成Au-S键进行结合即可得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/识别肽信号探针。一种检测PS外泌体生物传感器的测试方法，包括：将待测外泌体溶液在所述的生物传感电极上孵育，使PS阳性外泌体捕获在生物传感器电极上，随后将所述的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/识别肽信号探针溶液在捕获有PS阳性外泌体的生物传感器电极上孵育，使探针结合在生物传感器电极的PS阳性外泌体上，从而组成信号探针和生物传感器电极夹载PS外泌体的识别肽基三明治型生物传感器，对该电致化学发光生物传感器在含H2O2的PBS溶液中进行检测，通过信号探针产生电致化学发光信号，从而指示PS外泌体的含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术用结合识别肽技术构建出高效电致化学发光(ECL)传感平台来检测PS外泌体。在该策略利用特异性识别肽代替抗体，可有效区分肿瘤源外泌体和正常外泌体，提高了检测系统的选择性和稳定性。另外，该传感器可用于检测血清中的肿瘤源外泌体，适用于临床检测。附图说明图1为本公开电致化学发光传感器的组装及检测示意图。图2为实施例1制备的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4纳米材料的透射电子显微镜图。图3为实施例1制备中不同浓度PS外泌体对ECL响应的影响(A)及校正曲线(B)。图4为实施例4制备中SKOV3ip卵巢肿瘤细胞和HMrSV5正常细胞分泌外泌体的ECL响应(A)及检测不同介质中的SKOV3ip外泌体(B)。具体实施方案下面结合附图和具体实施方案对本专利技术作出进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。正如
技术介绍
所介绍的，需要开发一种用于高灵敏和特异性检测PS外泌体的分析技术，针对此，本专利提供一种检测PS阳性肿瘤源外泌体生物传感器及制备方法。电致化学发光传感器的组装及实验原理：电致化学发光传感器的组装及检测原理如图1所示，在玻碳电极(GCE)表面沉积AuNPs，AuNPs具有优异的生物相容性和导电性，且可以提供更多的识别位点以固定PS识别肽，从而捕获更多的外泌体，并使用牛血清白蛋白作为封闭剂防止非特异性吸附。接着合成鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/PS识别肽信号探针与外泌体结合，形成三明治结构，最后利用g-C3N4和AuNPs对H2O2的双重催化性能，提高鲁米诺-H2O2体系的ECL发光效率，利用产生的电致化学发光信号的强弱来反映捕获PS阳性外泌体的多少，从而达到检测外泌体的目的。电致化学发光信号较强则在电极表面的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/PS识别肽信号探针较多，从而间接的说明在电极上的PS阳性外泌体较多。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。实施例11、g-C3N4纳米片和鲁米诺-AuNPs的合成...

【技术保护点】
1.一种检测磷酯酰丝氨酸(PS)阳性外泌体的生物传感器，其特征在：以PS特异性识别肽作为识别元件，识别肽组装的生物传感电极作为捕获基底，由g-C

【技术特征摘要】
1.一种检测磷酯酰丝氨酸(PS)阳性外泌体的生物传感器，其特征在：以PS特异性识别肽作为识别元件，识别肽组装的生物传感电极作为捕获基底，由g-C3N4纳米片、鲁米诺-AuNPs和识别肽组成的电致化学发光探针作为信号探针。


2.根据权利要求1所述的PS特异性识别肽，其特征在于：氨基酸序列为FNFRLKAGAKIRFGRGC，序列中下划线部分为PS特异性识别序列，RGC为键连序列，末端半胱氨酸C中的巯基可以与金结合。


3.根据权利要求1所述的捕获基底，其制备方法特征在于：以氯金酸溶液为电沉积底液，玻碳电极为工作电极，采用恒电位沉积方法，制备出AuNPs修饰的玻碳电极，进一步用去离子水冲洗、室温晾干后，将修饰电极浸入识别肽溶液中进行孵育并冲洗；随后再将修饰电极浸入牛血清蛋白中进行封闭，得到识别肽组装的生物传感电极。


4.根据权利要求3所述的捕获基底制备方法中，所述氯金酸溶液的质量分数为1%，恒电位沉积的电压为-0.2V，沉积时间为10～30s；所述识别肽水溶液的浓度为0.2～1μM，在4℃孵育0.5～12h；牛血清蛋白水溶液的质量分数为0.2%～1%，在4℃下孵育0.5～1h。


5.根据权利要求1所述的信号探针，其制备方法特征在于：将g-C...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈旭，刘雪娇，杨文胜，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11