具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种具有高效基因递送能力的三维星型α螺旋聚多肽及其制备方法与应用，以树枝状分子为引发剂，二氯甲烷为反应溶剂，引发不同类型的N‑羧酸酐单体的高速开环聚合，并通过点击化学反应在末端引入不同电性的基团。树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，同时拓扑结构为开环聚合反应初期的加速作用提供了契机。聚多肽侧链修饰的胍基/氨基等带来了较高的正电荷密度，可以通过正负电荷间的静电作用获得高效的基因负载能力，且增强了二级结构上的α螺旋刚性结构进而使聚多肽拥有更强的穿膜能力；该类聚多肽的这些性能使其在生物医用材料尤其是基因递送领域中具有巨大的开发前景。

Three dimensional spherical alpha helix cationic polypeptides with high gene delivery efficiency and their preparation and Application

The invention provides a three-dimensional star type \u03b1 - helix polypeptide with high-efficiency gene delivery ability, a preparation method and application thereof. Taking dendrimers as initiators and dichloromethane as reaction solvent, it initiates high-speed ring opening polymerization of different types of N-carboxyanhydrides, and introduces different electric groups at the end through point impact chemical reaction. The abundant amino groups on the surface of dendrimers provide enough polymerization sites to form a three-dimensional spherical topological structure of polypeptides. At the same time, the topological structure provides an opportunity to accelerate the initial stage of ring opening polymerization. The guanidine group / amino group modified by the side chain of polypeptide brings about higher positive charge density, which can obtain high-efficiency gene loading capacity through the electrostatic interaction between positive and negative charges, and enhance the \u03b1 helix rigid structure on the secondary structure, so that the polypeptide has stronger ability to penetrate the membrane; these properties of the polypeptide make it have great potential in biomedical materials, especially in the field of gene delivery Great development prospect.

【技术实现步骤摘要】
具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因负载和递送领域，具体涉及具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用，可应用于乳腺癌的光热-基因联合治疗。
技术介绍
基因递送载体是用于负载核酸分子，将其导入目标靶细胞并成功表达的必要的介质，主要分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体由于转导效率和表达效率高的优势得到了广泛的利用，但其本身的抗原性，潜在的致瘤风险以及基因装载量不足的缺点严重制约了其发展。基于此，非病毒载体渐渐得到重视。常用的非病毒载体有脂质体、纳米颗粒、阳离子聚合物和多糖等。α螺旋聚多肽，特别是阳离子型聚多肽作为一类新型、高效的基因递送载体，虽然归属于此类，但与传统的聚合物的内吞机制不同，这类聚多肽主要通过α螺旋的刚性二级结构在生物膜上“打孔”的模式穿透细胞膜。但高剂量使用或与细胞长时程接触时，聚多肽会在生物膜上打出过多的孔道，造成显著的细胞毒性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种三维拓扑结构的星型聚多肽，选用树枝状分子为引发剂，分别以二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，引发N-羧酸酐单体的开环聚合，并通过小分子修饰得到。树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，并且由于二氯甲烷的低介电常数的性质，开环聚合初期形成的拓扑结构促进了后期聚合的加速，大大缩短了聚合所需的时间，本专利技术阳离子聚多肽利用自身的正电荷通过正负电荷间的静电作用吸附并压缩核酸分子，同时主要利用聚合物同时主要利用聚合物的刚性的α螺旋结构在细胞膜表面打孔并进行穿膜，其中侧基为胍基的聚多肽的穿膜能力比Arg9、HIV-Tat等经典细胞穿膜肽提高了1~2个数量级。如果将胍基等正电荷基团和芳香基团共同引入聚多肽侧链，可以通过疏水作用又能够提高聚多肽与siRNA的复合能力，从而提高聚多肽的基因沉默效率。若共同引入负电荷基团则能提高聚多肽的体内循环能力。另外α螺旋阳离子聚多肽也可以在溶酶体/内含体膜上“打孔”，因此可以高效地低能耗地递送核酸分子进胞并逃避内含体/溶酶体，实现高效的基因转染。本专利技术采用如下技术方案：一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，具有式（I）所示的结构；式中，R1为树枝状分子聚丙烯酰胺单元，R2为N-羧酸酐单体单元，R3为电性小分子单元。上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括如下步骤，将树枝状分子聚丙烯酰胺引发N-羧酸酐化合物聚合得到中间体；然后将中间体与电性小分子反应，得到具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。上述三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法具体包括如下步骤：（1）具有式（II），式（III），式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐或者N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐；（2）将所述中间体与电性小分子通过点击化学反应得到式（I）具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。本专利技术公开了一种中间体，其制备方法具体包括如下步骤：（1）具有式（II），式（III），式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐或者N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐。本专利技术中，步骤（1）中，所述有机溶剂为二氯甲烷时，反应为室温下反应0.5～1h；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺时，反应为室温下反应72h；步骤（2）中，点击化学反应以五甲基二乙烯三胺、溴化亚铜为催化体系，反应为室温反应24h。本专利技术公开了一种纳米药物，包括上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽与核酸分子；所述核酸药物包括DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸。进一步的，所述纳米药物还包括其他药物，比如吲哚菁绿。本专利技术还公开了一种纳米药物的制备方法，包括以下步骤，将上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽溶解于DEPC水中，然后与核酸溶液混合，再置于37℃水浴孵育30min后得到纳米药物。核酸药物选自DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸，具体的，所述DNA为质粒DNA，可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。其中，具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽与核酸的质量比为（1~30）：1，优选的质量比为（8~20）：1，更优选的质量比为（10~15）：1。所述纳米药物的粒径为100~1000nm，优选的粒径为100~500nm，更优选的粒径为100~150nm。所述纳米药物的Zeta电势为-20～70mV。本专利技术公开了上述中间体在制备具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽或在制备基因药物载体中的应用。上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽在制备基因药物载体中的应用；或者上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽在制备基因药物中的应用；或者上述纳米药物在制备基因药物中的应用。优选的，基因药物为治疗乳腺癌的药物。本专利技术涉及的基团、化合物或者聚合物的化学结构式如下：所述γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐单体、N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐单体的化学结构式分别为：步骤（2）中，电性小分子的化学结构式如下之一：、、、、、、、、。中间体的化学结构式为:树枝状分子聚丙烯酰胺的化学结构式如下：其中，a为2～8，优选2,3,4,5；具体为：N-羧酸酐单体单元来自不同N-羧酸酐单体的开环聚合，其结构式具体为以下一种：电性小分子单元选自以下基团的一种：、、、、、、、、本专利技术中，n代表聚多肽主链的重复单元数，即聚合度，n为20～200，比如n=20,50,100,200；m为1～6，比如m=1,4,6。本专利技术设计的聚多肽可以通过点击化学反应在末端引入不同电性基团，其中三维球形α螺旋阳离子聚多肽，树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，同时拓扑结构为开环聚合反应初期的加速作用提供了契机。聚多肽侧链修饰的胍基带来了较高的正电荷密度，可以通过正负电荷间的静电作用获得高效的基因负载能力，且增强了二级结构上的α螺旋刚性结构进而拥有更强的穿膜能力。一种详细的具有式（Ⅰ）结构的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法，如下：①以L-谷氨酸和水合醋酸铜为原料，制备L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物；以对羟基苯甲醇、溴丙炔、氯化亚砜、L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物和双(三氯甲基)碳酸酯为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽具有式（I）所示的结构；/n

【技术特征摘要】
1.一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽具有式（I）所示的结构；



式（I）
式（I）中，R1为树枝状分子聚丙烯酰胺单元，R2为N-羧酸酐单体单元，R3为电性小分子单元；n为20～200。


2.根据权利要求1所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括如下步骤，将树枝状分子聚丙烯酰胺引发N-羧酸酐化合物聚合得到中间体；然后将中间体与电性小分子反应，得到具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。


3.根据权利要求2所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括如下步骤：
（1）具有式（II）、式（III）、式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐或者N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐；
（2）将所述中间体与电性小分子通过点击化学反应得到具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。


4.根据权利要求3所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，步骤（1）中，所述有机溶剂为二氯甲烷时，反应为室温下反应0.5～1h；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺时，反应为室温下反应72h；步骤（2）中，点击化学反应以五甲基二乙烯三胺、溴化亚铜为催化体系，反应为室温反应24h。


5.一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷黎晨，叶桓，党娟娟，侯梦滢，朱蓉英，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32