缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物及制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一种缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物及制备和应用，壳聚糖的重均分子量为2000Da‑20000Da，硝基咪唑的接枝率为1～20％。本发明专利技术采用具有良好生物相容性的壳聚糖为亲水性材料，以N‑Boc‑溴代烷胺为桥联基团，选择硝基咪唑为缺氧敏感基团，合成具有缺氧敏感响应性的壳聚糖硝基咪唑嫁接物。该嫁接物材料在水中自聚集形成聚合物胶束，具有较低的临界胶束浓度，该壳聚糖硝基咪唑嫁接物可作为药物载体，与药物组合，构建的载药纳米粒，可在缺氧细胞内高表达的硝基还原酶作用下，快速释放药物，实现药物在肿瘤、脑卒中等缺氧病灶环境中的靶向释放，提高药效。本发明专利技术的壳聚糖硝基咪唑嫁接物的结构式为：

Preparation and application of nitroimidazole grafted chitosan sensitive to hypoxia

The invention provides a kind of oxygen sensitive responsive chitosan nitroimidazole graft and its preparation and application. The weight average molecular weight of chitosan is 2000Da \u2011 20000da, and the grafting rate of nitroimidazole is 1-20%. The invention adopts chitosan with good biocompatibility as hydrophilic material, n \u2011 BOC \u2011 bromoalkylamine as bridging group, and nitroimidazole as hypoxia sensitive group to synthesize chitosan nitroimidazole graft with hypoxia sensitive response. The chitosan nitroimidazole graft can be used as a drug carrier, combined with drugs, to construct drug loaded nanoparticles, which can release drugs rapidly under the action of nitroreductase with high expression in hypoxic cells, and achieve the target release of drugs in the environment of tumor and cerebral apoplexy Release and improve the efficacy. The structure formula of the chitosan nitroimidazole graft of the invention is:

【技术实现步骤摘要】
缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物及制备和应用
本专利技术属化合物合成，涉及缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物的合成方法，及壳聚糖硝基咪唑嫁接物作为缺氧敏感响应性药物释放载体中的应用。
技术介绍
纳米药物可实现病灶部位靶向分布，药物靶向递送可提高药物有效性，降低毒副作用。但纳米药物病灶靶部位释放尚存在问题。根据疾病的病理性质，设计环境响应性药物载体，是实现药物靶向释放的有效手段。机体在缺氧条件下，将发生一系列生理病理变化。氧气是细胞进行正常生理活动所必需物质。缺氧时糖酵解过程逐渐代替有氧呼吸，成为细胞能量代谢的主要途径，由此而导致细胞内代谢产物类型发生变化，乳酸堆积，胞内pH值改变。由于缺氧时细胞供能不足，线粒体、高尔基体、内质网等耗能细胞器生理功能异常。同时，胞内酶表达谱发生变化，细胞生理功能相关信号通路改变。缺氧还可引起细胞应激反应，导致基因损伤。缺氧是多种疾病发生发展的原因。肿瘤是人类疾病死亡的第二大原因。肿瘤发展过程中，肿瘤细胞快速增殖，有氧呼吸旺盛，对氧的消耗增加，导致局部缺氧。肿瘤组织血管形成不完全，脉管系统缺失，血液输送和氧气输送能力弱。同时肿瘤组织体积不断增长，造成对周围血管的挤压，进一步降低血供。上述肿瘤组织的病理特性和结构特征，共同导致肿瘤缺氧。缺氧引起肿瘤细胞代谢途径改变，糖酵解作用增加，细胞内代谢产物发生变化，造成乳酸堆积，肿瘤微环境pH值降低。同时，缺氧破坏细胞内氧化还原平衡的内稳态，细胞内硝基还原酶(Nitroreductase,NTRs)、缺氧诱导因子(Hypoxiainducedfactor-1α,HIF-1α)等蛋白表达增加，导致肿瘤恶性程度及肿瘤干细胞样性质增加。因此，缺氧是导致肿瘤恶化的重要环境因素之一。另外，脑缺血、冠心病等心脑血管疾病中，血管阻塞引起局部血液循环停滞，病灶部位氧气供应受阻，导致神经细胞或心肌细胞缺氧受损，产生炎症，引发局部坏死，造成机体器质性损伤。缺氧相关疾病的治疗方法，主要为改善局部氧供和保护病灶部位缺氧细胞。前期研究结果显示，以壳聚糖(重均分子量2000Da-20000Da)为骨架结构链接脂肪酸，构建聚合物胶束药物递释系统，可有效包封治疗药物，将药物递送至肿瘤等缺氧病灶。壳聚糖具有生物相容性好、毒性低、水溶性好等优点，壳聚糖链接脂肪酸构建的药物载体，能被多种细胞高效摄取。但以现有的壳聚糖脂肪酸嫁接物，构建药物递释系统，在缺氧病灶部位难以实现快速有效的药物释放。针对缺氧相关疾病的特点，利用缺氧时细胞的生理参数变化，设计缺氧敏感响应性药物递释系统，有可能显著提高药物在缺氧病灶快速有效释放。硝基还原酶(NTRs)是细胞内一类将硝基芳香化合物催化还原为芳香胺的酶。缺氧状态下，NTRs以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Reducedformofnicotinamide-adeninedinucleotide,NADH)为电子供体，可催化多种外源性硝基芳香族化合物发生单电子转移，生成硝基阴离子自由基，并进一步将硝基阴离子自由基还原成羟胺或氨基。2-硝基咪唑为一种疏水的硝基芳香族化合物，经NTRs作用后，可还原为亲水的2-氨基咪唑。选择2-硝基咪唑为疏水基团，与亲水性材料壳聚糖链接，构建两亲性嫁接物药物载体，可在缺氧细胞高表达NTRs的作用下，将载体材料疏水端转变为亲水性基团，促使嫁接物胶束结构缺氧响应性解聚，实现药物缺氧敏感释放。
技术实现思路
为了提高药物在缺氧病灶部位的靶向快速有效释放，本专利技术的目的是提供一种壳聚糖硝基咪唑嫁接物，具有以下式所表示的结构单元：其中，N-Boc-溴代烷胺的溴原子被硝基咪唑取代，壳聚糖链上的部分自由氨基通过酰胺键，与脱去了N端BOC保护的N-BOC-烷胺的氨基相连，壳聚糖的重均分子量为2000Da-20000Da，硝基咪唑的接枝率为1～20％，壳聚糖硝基咪唑嫁接物在水溶液中的临界胶束浓度为15.63～103.5μg/mL。本专利技术的另一个目的是提供壳聚糖硝基咪唑嫁接物的制备方法，通过以下方案实现：称取定量2-硝基咪唑，2-硝基咪唑0.5～5倍摩尔量的碳酸钾和2-硝基咪唑0.8～3倍摩尔量的N-Boc-溴代烷胺(烷基碳原子个数为6-12)置于50mL干燥圆底烧瓶中，加入10～20mL脱水N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)，在恒温加热磁力搅拌器中80℃反应4h～8h。反应结束后，离心取反应液上清液，投入反应液5倍体积量的去离子水和反应液1倍体积量的乙酸乙酯萃取，气浴振荡器上室温振荡5min，静置30min，待液体分层，取上层乙酸乙酯，置于25mL圆底烧瓶，旋转蒸发仪上40℃旋蒸，至烧瓶中溶液完全除去。烧瓶中加入适量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，2-硝基咪唑0.5～5倍摩尔量的二琥珀酰亚胺酯(N,N'-DisuccinimidylCarbonate,DSC)，2-硝基咪唑2～10倍摩尔量的壳聚糖(重均分子量＝2000-20000Da)和DMF等倍体积量的去离子水，在恒温加热磁力搅拌器中40℃反应24h，得反应产物。反应产物置于透析袋(MWCO1000～3500Da，北京经科宏达生物技术有限公司)中透析48h，以除去DMF和水溶性副产物。透析后反应产物冷冻干燥，得壳聚糖硝基咪唑嫁接物。本专利技术的再一个目的是提供所述壳聚糖硝基咪唑嫁接物在作为细胞毒类抗肿瘤药物载体中的应用。所述药物可以是细胞毒类抗肿瘤药物，MAPK信号通路抑制剂，PI3K信号通路抑制剂，cMYC抑制剂和脂溶性荧光染料等，例如，阿霉素、紫杉醇、SB203580、LY294002、阿西替尼、JQ1、香豆素、尼罗红等。体外实验证明，本专利技术所述壳聚糖硝基咪唑嫁接物作为载体，在含有硝基还原酶10-100μmol的37℃、pH7.4磷酸缓冲盐溶液中，或在37℃、5％CO2+95％空气条件下、在含有10～500μmol氯化钴的DMEM培养液培养的肿瘤细胞中，或在37℃、5％CO2+95％N2条件下，培养液为含10％胎牛血清的DMEM培养液培养的肿瘤细胞中，快速释放药物。本专利技术采用具有良好生物相容性的壳聚糖为亲水性材料，以N-Boc-溴代烷胺为桥联基团，选择硝基咪唑为缺氧敏感基团，合成具有缺氧敏感响应性的壳聚糖硝基咪唑嫁接物。该嫁接物材料在水中自聚集形成聚合物胶束，具有较低的临界胶束浓度，该壳聚糖硝基咪唑嫁接物可作为药物载体，与药物组合，构建的载药纳米粒，可在缺氧细胞内高表达的硝基还原酶作用下，快速释放药物，实现药物在缺氧病灶环境中的靶向释放，提高药效。本专利技术的特点为：(1)本专利技术首次构建了可用于包封药物的壳聚糖嫁接硝基咪唑聚合物药物载体。(2)本专利技术构建的壳聚糖硝基咪唑聚合物载体，可显著提高壳聚糖脂肪酸嫁接物药物递释系统在缺氧细胞内的药物释放效率。(3)本专利技术构建的壳聚糖硝基咪唑聚合物载体，可与多种药物如阿霉素、紫杉醇、SB203580、LY294002、阿西替尼、JQ1、香豆素、尼罗红等，构建药物递释系统。构建的药物递释系统性质稳定，均可实现在含有硝基还原酶10-100μmol的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物，其特征在于，具有下式所表示的结构单元：/n

【技术特征摘要】
1.一种缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物，其特征在于，具有下式所表示的结构单元：



其中，N-Boc-溴代烷胺的溴原子被硝基咪唑取代，壳聚糖链上的部分自由氨基通过酰胺键，与脱去了N端BOC保护的N-BOC-烷胺的氨基相连，壳聚糖的重均分子量为2000Da-20000Da，硝基咪唑的接枝率为1～20％，壳聚糖硝基咪唑嫁接物在水溶液中的临界胶束浓度为15.63～103.5μg/mL。


2.权利要求1所述的缺氧敏感响应型壳聚糖硝基咪唑嫁接物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
分别称取2-硝基咪唑，2-硝基咪唑0.5～5倍摩尔量的碳酸钾和2-硝基咪唑0.8～3倍摩尔量的N-Boc-溴代烷胺置于50mL干燥圆底烧瓶中，加入20～50mL脱水N,N-二甲基甲酰胺，在恒温加热磁力搅拌器中80℃反应4～8h。反应结束后，适量乙酸乙酯萃取反应产物，置于圆底烧瓶40℃旋蒸除去溶剂，烧瓶中加入适量N,N-二甲基甲酰胺，2-硝基咪唑0.5～5倍摩尔量的二琥珀酰亚胺酯，2-硝基咪唑2～10倍摩尔量的壳聚糖和N,N-二甲基甲酰胺等倍体...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡富强，刘璇，商旭炜，周雪晴，袁弘，孟廷廷，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33