共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用技术

本发明专利技术涉及基于TYLCV‑C1蛋白的蛋白与核酸的共价连接，其利用TYLCV‑C1蛋白的催化作用，将目标蛋白与目标核酸共价连接形成蛋白核酸复合物，其反应条件温和，反应耗时短，效率高达93％，25℃反应10min即可，且TYLCV‑C1蛋白对目标蛋白及目标核酸的功能及性质无负面影响。

The method and application of covalent linking nucleic acid and peptide or protein

The invention relates to covalent connection of protein and nucleic acid based on TYLCV \u2011 C1 protein, which uses the catalysis of TYLCV \u2011 C1 protein to covalently connect the target protein and target nucleic acid to form protein nucleic acid complex. The reaction conditions are mild, the reaction time is short, the efficiency is as high as 93%, the reaction time is 10 minutes at 25 \u2103, and the function and property of TYLCV \u2011 C1 protein to target protein and target nucleic acid are not negative Surface effect.

【技术实现步骤摘要】
共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用
本专利技术涉及-生物交联、纳米
，具体涉及基于TYLCV-C1蛋白自催化的蛋白与核酸的定点共价连接。
技术介绍
蛋白核酸复合物，由于具备了蛋白质功能多样性以及核酸的可编程性，使其在生物技术上研究十分广泛。目前在核酸纳米结构上构建的多酶体系、固相载体如生物芯片上的蛋白固定、生物分子递送、高分辨成像技术上已有大量工作报导。但在上述技术中，所采用的蛋白核酸连接方法，大部分为化学交联，蛋白核酸随机连接，无法确定核酸连接的数目与状态，不仅需要对目的蛋白或核酸进行预修饰，而且反应过程会使蛋白不同程度失活，如通过化学交联剂预先修饰处理的核酸与蛋白表面的氨基或巯基反应形成共价连接，如利用交联剂(如sSMCC)的作用将烷硫基(Alkylthiol)修饰的核酸与表面含氨基的蛋白形成共价结合。也有采用酶促连接的方法，如通过在谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)的作用下，修饰Z-QG(N-carbobenzyloxyglutaminylglycine)的核酸与融合有MKHKGS短肽的蛋白产生共价结合，但这类方法反应前需要对核酸、蛋白均进行修饰，应用受限。还有一些非共价结合方法，如通过亲和素(或链霉亲和素)与生物素的作用，金属离子与蛋白识别结构域的结合(如镍离子与聚组氨酸的结合)等实现蛋白核酸连接，但这些作用相对于共价结合，结合力低，受坏境影响，不稳定性高，应用受限。所以目前蛋白核酸连接技术有待发展，急需要一种稳定、高效、反应条件温和、化学计量比可控的共价定点连接技术。专利
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种TYLCV-C1蛋白，其能够识别特定的目标核酸序列并进行剪切，将剪切后的目标核酸直接共价连接到TYLCV-C1蛋白的酪氨酸上，再通过TYLCV-C1蛋白与目标蛋白连接，从而实现定点、定向共价连接，而不影响蛋白及核酸的结构或性能。TYLCV-C1蛋白为番茄黄化曲叶病毒的复制相关蛋白(Replication-associatedprotein)，为该病毒的C1基因编码，在病毒单链DNA的复制中起着重要作用。其在病毒基因间隔区域的识别序列上进行剪切引入缺口，从而启动滚环复制(rollingcirclereplication，RCR)。本专利技术提供一种共价连接核酸和肽或蛋白的方法，其包括使用TYLCV-C1蛋白共价连接目标核酸和目标肽或蛋白。所述目标肽可为有生物活性多肽或人工合成多肽等。例如，细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其它药用小肽以及诊断用多肽等。其中，活性肽又可为免疫活性肽、神经活性肽、胆固醇肽、促进矿物质吸收的肽(CPPS)、酶调节剂(如促胰酶肽)、激素肽如生长激素释放因子(GRFS)、白蛋白胰岛素增效肽、抗菌多肽(如乳酸链球菌素、橡胶素)、抗癌多肽(如肿瘤细胞坏死因子、环已肽)、抗艾滋病肽(如GLQ蛋白)等。所述的目标蛋白可为单体蛋白、寡聚蛋白、多聚蛋白等。按其来源可为动物蛋白、植物蛋白或人工合成蛋白等。其中，所述的目标肽或蛋白可以根据实际需要进行选择。所述TYLCV-C1蛋白包括完整的天然的TYLCV-C1蛋白、经过改造的TYLCV-C1蛋白或TYLCV-C1蛋白结构域，所述经过改造的TYLCV-C1蛋白或TYLCV-C1蛋白结构域具有核酸酶的催化活性。在本专利技术的一个具体实施方式中，连接所述核酸和所述肽或蛋白的方法中，还包括，在使用所述TYLCV-C1蛋白连接所述核酸和所述肽或蛋白之前，在所述核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基。示例性地，所述x为1-30个核苷酸碱基。优选地，所述x为2-20个核苷酸碱基。更优选地，所述x为5-10个核苷酸碱基。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述x为7个核苷酸碱基。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。其中，序列tatta为TYLCV-C1蛋白的识别序列，cgtataa序列有助于TYLCV-C1蛋白的识别。在本专利技术的一个具体实施方式中，其中所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白。当然本专利技术中所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白的连接也可通过现有技术中的其他方式进行连接，如通过化学修饰连接，或非共价结合等。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接。融合蛋白的设计中，经常需要用连接肽将不同功能的蛋白进行连接融合。连接肽的设计和选择对融合蛋白的表达、稳定性及功能活性至关重要。常见的两种连接肽分为柔性和刚性，其中柔性连接肽即成柔软线性的一类易折弯的氨基酸序列，刚性连接肽即成稳固螺旋结构的一类长度固定的氨基酸序列。设计连接肽时应考虑长度、氨基酸成分、亲水性、构象、柔韧性及电荷等影响。连接肽中的氨基酸组成对柔性连接头影响较大，而氨基酸排列影响着刚性连接肽的结构。连接肽的长度直接影响着功能蛋白的间距，过程或过短的连接肽均会影响融合蛋白的稳定性与活性等。长度过短会导致空间位阻效应，两端的蛋白不能充分折叠或展开，形成错误构型或阻碍活性位点，造成融合蛋白无活性或低活性，二聚体形式大量出现；过长会导致融合蛋白整体结构松散，易被宿主细胞中的蛋白酶水解切断，失去融合意义。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性多肽连接。所述柔性连接肽的序列可依据目标肽或蛋白进行选择。柔性连接肽的序列，例如可为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG、GGGGSGGGSGG等。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性多肽GGGGS连接。在本专利技术第一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过刚性连接肽连接。刚性连接肽的序列如：EAAAK，(EAAAK)2，(EAAAK)3，(EAAAK)4，(EAAAK)5，(EAAAK)6，AEAAAKA，A(EAAAK)2A，A(EAAAK)3A，A(EAAAK)4A，A(EAAAK)5A，A(EAAAK)6A等。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或其同源序列。示例性地，所述同源序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共价连接核酸和肽或蛋白的方法，其包括使用TYLCV-C1蛋白共价连接目标核酸和目标肽或蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种共价连接核酸和肽或蛋白的方法，其包括使用TYLCV-C1蛋白共价连接目标核酸和目标肽或蛋白。


2.根据权利要求1所述的方法，其包括在使用所述TYLCV-C1蛋白连接所述核酸和所述肽或蛋白之前，在所述核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基；优选地，所述x为1-30个核苷酸碱基。


3.根据权利要求2的所述的方法，其中所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白。


5.根据权利要求4的方法，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接；优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性连接肽连接形成融合蛋白。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或其同源序列。


7.TYLCV-C1蛋白在目标肽或蛋白与目标核酸连接中的用途。


8.根据权利要求7所述的用途，所述的目标核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基；优选地，所述x为1-30个核苷酸碱基；优选地，所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。


9.根据权利要求8所述的用途，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白；优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接；优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性连接肽连接形成融合蛋白。


10.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：门冬，张先恩，周昆，曹姗姗，周娟，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42