抗肿瘤嵌合蛋白、抗肿瘤疫苗和鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗制造技术

本发明专利技术属于生物医药的技术领域，尤其涉及抗肿瘤嵌合蛋白、抗肿瘤疫苗和鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗。本发明专利技术提供了一种抗肿瘤嵌合蛋白，包括：第一多肽，包括用于增强免疫反应的淋巴因子序列和霍乱毒素的CTA2亚基序列；第二多肽，包括霍乱毒素的CTB亚基序列和肿瘤特异性抗原表位肽序列；所述第一多肽的霍乱毒素的CTA2亚基和所述第二多肽的霍乱毒素的CTB亚基相互嵌合得到抗肿瘤嵌合蛋白。本发明专利技术提供了抗肿瘤嵌合蛋白、抗肿瘤疫苗和鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗，用于解决现有技术中的肿瘤疫苗免疫原性差的技术缺陷。

Antitumor chimeric protein, antitumor vaccine and antitumor vaccine administered by nasal mucosa

The invention belongs to the technical field of biomedicine, in particular to anti-tumor chimeric protein, anti-tumor vaccine and anti-tumor vaccine for nasal mucosa administration. The invention provides an anti-tumor chimeric protein, which comprises: a first polypeptide, including a lymphokine sequence for enhancing immune response and a CTA2 subunit sequence of cholera toxin; a second polypeptide, including a CTB subunit sequence of cholera toxin and a tumor specific antigen epitope peptide sequence; a CTA2 subunit of cholera toxin of the first polypeptide and a CTB subunit of cholera toxin of the second polypeptide The anti-tumor chimeric protein was obtained by chimerism. The invention provides an anti-tumor vaccine for anti-tumor chimeric protein, anti-tumor vaccine and nasal mucosa administration, which is used to solve the technical defect of poor immunogenicity of the tumor vaccine in the prior art.

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤嵌合蛋白、抗肿瘤疫苗和鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗
本专利技术属于生物医药的
，尤其涉及抗肿瘤嵌合蛋白、抗肿瘤疫苗和鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗。本申请要求2018年09月25日提交的中国专利(专利申请号为201811119727.6)的权益，在此将上述申请的全部内容引用并入本文。
技术介绍
肿瘤疫苗是近年来肿瘤学研究的热点，其通过肿瘤特异性抗原或抗原多肽的给药，激活、恢复或加强机体抗肿瘤的免疫反应，进而杀伤、清除表达肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞。然而，肿瘤疫苗研制存在着一个主要问题，就是肿瘤抗原的免疫原性较弱，不能被免疫系统识别并呈递以激活毒性T淋巴细胞(CTL)，发挥不了免疫治疗的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能主动诱发CTL反应，安全且具免疫原性的抗肿瘤嵌合蛋白、抗肿瘤疫苗和鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗。本专利技术提供了一种抗肿瘤嵌合蛋白，包括：第一多肽，包括用于增强免疫反应的淋巴因子序列和霍乱毒素的CTA2亚基序列；第二多肽，包括霍乱毒素的CTB亚基序列和肿瘤特异性抗原表位肽序列；所述第一多肽的霍乱毒素的CTA2亚基和所述第二多肽的霍乱毒素的CTB亚基相互嵌合得到抗肿瘤嵌合蛋白。本专利技术巧妙利用了霍乱毒素(choleratoxin，CT)的结构特点，霍乱毒素是从霍乱弧菌分离得到的毒素蛋白，可以致人严重脱盐引起腹泻，一个霍乱分子由5个相同的B亚基(CTB)和一个A亚基(CTA)组成，CTA通过疏水作用与CTB5形成稳定的六聚体，CTA包括CTA1和CTA2，CTA1具有致病性。其中，CTB的基因库登录号为GenBank：AND74811.1，在设计时，将天然的CTB前端信号肽切除，使得CTB在大肠杆菌细胞内大量表达为包涵体形式。此外，CTB的C端有5个融合表位连接处，因此，可以提高连接表位的免疫原性，增大免疫强度。其中，CTA2亚基非共价紧密结合于CTB五聚体亚基的中心区，形成支架将GM-CSF与CTB五聚体亚基嵌合在一起。需要说明的是，所述第一多肽是将淋巴因子通过连接肽与CTA2连接，连接肽为常用的连接肽，例如：GGGGS或ASGG。需要说明的是，所述第二多肽是将霍乱毒素的CTB通过连接肽与肿瘤特异性抗原表位肽序列连接，连接肽为常用的连接肽，例如：GGGGS或ASGG。作为优选，所述霍乱毒素的CTB亚基序列如SEQIDNo:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与所述霍乱毒素的CTB亚基序列至少有80％同源性、且能与所述霍乱毒素的CTA2亚基相互结合。作为优选，所述霍乱毒素的CTA2亚基序列如SEQIDNo:2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与所述霍乱毒素的CTA2亚基序列至少有80％同源性、且能与所述霍乱毒素的CTB亚基相互结合。作为优选，所述淋巴因子选自粒-单核细胞集落刺激因子。作为优选，所述粒-单核细胞集落刺激因子如SEQIDNo:3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与所述粒-单核细胞集落刺激因子至少有80％同源性、且功能相同或相似的氨基酸序列。需要说明的是，细胞因子GM-CSF(粒-单核细胞集落刺激因子)能同时增强体液免疫和细胞免疫。GM-CSF主要有促抗体反应和促T淋巴细胞增殖作用，本专利技术将增强体液免疫和细胞免疫的淋巴因子与CTA2连接，从而使得抗肿瘤嵌合蛋白具有更多的功能，GM-CSF能激发T淋巴细胞的增殖活性，进而达到杀伤肿瘤效应。本申请的抗肿瘤嵌合蛋白中的淋巴因子GM-CSF也可以选择其他具有刺激体液免疫或细胞免疫活性的细胞因子如IL-2替换。作为优选，所述肿瘤特异性抗原表位肽序列选自前列腺癌特异性抗原表位肽序列。本申请的肿瘤特异性抗原表位肽序列可以选择目前已被证实的肿瘤特异性抗原表位肽，从而用于其他肿瘤的免疫治疗。作为优选，所述肿瘤特异性抗原表位肽序列为前列腺癌特异性抗原表位肽(PSMA624-632)，PSMA624-632是前列腺癌特异性抗原序列的第624-632处的多肽片段，PSMA624-632能靶向治疗前列腺癌。作为优选，所述前列腺癌特异性抗原表位肽序列如SEQIDNo:4所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与所述前列腺癌特异性抗原表位肽序列至少有80％同源性、且功能相同或相似的氨基酸序列。作为优选，所述的抗肿瘤嵌合蛋白，所述第一多肽还包括细胞穿膜肽序列；所述用于增强免疫反应的淋巴因子序列、霍乱毒素的CTA2亚基序列和细胞穿膜肽序列顺次连接。需要说明的是，细胞穿膜肽CPPs有很多种，本申请选择阳离子型穿膜肽(TAT)，TAT可以穿越血脑屏障，具有强大的运载潜能，能将蛋白质、核酸片段等自身很难入胞的生物活性物质高效导入细胞内，转导效率高且不会造成细胞损伤。本申请的细胞穿膜肽可以选择目前被证实的基于天然的穿膜肽分子，也可以是人工设计合成的具有穿膜功能的短肽。细胞穿膜肽能促进淋巴因子通过CTA2的桥梁作用紧密与CTB的中心区嵌合。其中，阳离子型穿膜肽(TAT)与CTA2连接，加强CTA2的穿膜作用。优选的，第一多肽还包括用于蛋白纯化的标签，如His-tag。优选的，第二多肽还包括用于蛋白纯化的标签，如His-tag。本专利技术还提供了一种抗肿瘤疫苗，包括所述抗肿瘤嵌合蛋白。本专利技术还提供了一种鼻粘膜给药的抗肿瘤疫苗，包括所述抗肿瘤嵌合蛋白和鼻腔给药可接受的辅料。需要说明的是，霍乱毒素是一种鼻黏膜免疫佐剂，霍乱毒素被用于诱导更强的免疫应答的疫苗中(LiJ,ArévaloMT,ChenY,PosadasO,SmithJA,ZengM.IntranasalimmunizationwithinfluenzaantigensconjugatedwithcholeratoxinsubunitBstimulatesbroadspectrumimmunityagainstinfluenzaviruses.HumanVaccines&Immunotherapeutics.2014；10(5):1211-1220.doi:10.4161/hv.28407.)。因为霍乱毒素能经鼻吸收直接进入体循环减少疫苗用量，抑制不良反应，经鼻粘膜给药的方式与经口服给药相比可以降低疫苗的给药剂量，减少疫苗成本，增加给药顺从性。此外，本申请的抗肿瘤疫苗除了能鼻腔给药外，还能经口腔、腹腔、皮下等部位给药。本申请的抗肿瘤嵌合蛋白是基于霍乱毒素独特的结构为基础，结合肿瘤特异性抗原表位肽形成，将淋巴因子与CTA2连接形成第一多肽，将CTB与肿瘤特异性抗原表位肽连接形成第二多肽，在体外情况下，第一多肽与第二多肽通过酸碱共复性相互嵌合，抗肿瘤嵌合蛋白的淋巴因子通过CTA2的桥梁作用与CTB的结合区相互嵌合形成抗肿瘤嵌合蛋白，CTA2中含有内质网定位序列KDEL，引导抗肿瘤嵌合蛋白从反式高尔基体向内质网转移，当CTB通过与细胞膜上的神经节苷脂GM-1结合至抗原提呈细胞，使整个抗肿瘤嵌合蛋白锚着于细胞表面，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤嵌合蛋白，其特征在于，包括：/n第一多肽，包括用于增强免疫反应的淋巴因子序列和霍乱毒素的CTA2亚基序列；/n第二多肽，包括霍乱毒素的CTB亚基序列和肿瘤特异性抗原表位肽序列；/n所述第一多肽的霍乱毒素的CTA2亚基和所述第二多肽的霍乱毒素的CTB亚基相互嵌合得到抗肿瘤嵌合蛋白。/n

【技术特征摘要】
20180925 CN 20181111972761.一种抗肿瘤嵌合蛋白，其特征在于，包括：
第一多肽，包括用于增强免疫反应的淋巴因子序列和霍乱毒素的CTA2亚基序列；
第二多肽，包括霍乱毒素的CTB亚基序列和肿瘤特异性抗原表位肽序列；
所述第一多肽的霍乱毒素的CTA2亚基和所述第二多肽的霍乱毒素的CTB亚基相互嵌合得到抗肿瘤嵌合蛋白。


2.根据权利要求1所述的抗肿瘤嵌合蛋白，其特征在于，所述霍乱毒素的CTB亚基序列如SEQIDNo:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与所述霍乱毒素的CTB亚基序列至少有80％同源性、且能与所述霍乱毒素的CTA2亚基相互结合。


3.根据权利要求1所述的抗肿瘤嵌合蛋白，其特征在于，所述霍乱毒素的CTA2亚基序列如SEQIDNo:2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与所述霍乱毒素的CTA2亚基序列至少有80％同源性、且能与所述霍乱毒素的CTB亚基相互嵌合。


4.根据权利要求1所述的抗肿瘤嵌合蛋白，其特征在于，所述淋巴因子选自粒-单核细胞集落刺激因子。


5.根据权利要求4所述的抗肿瘤嵌合蛋白，其特征在于，所述淋巴因...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华倩，林丹敏，何华锋，孙家杰，龙威，郑希，卢宇靖，杜志云，赵肃清，张焜，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44