一种肝靶向配体及其在脂质体制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肝靶向配体及其在脂质体制剂中的应用，该配体是肝细胞生长因子经胰弹力蛋白酶水解获得的单链抗体片段，包括N末端的发夹结构和4个Kringle结构，即为NK4肝靶向配体；NK4肝靶向为NK4蛋白分子。本发明专利技术还利用配体NK4与肝细胞生长因子c‑Met受体特异性结合的原理，以HGF单链抗体片段NK4作为肝靶向配体制备NK4表面修饰脂质体制剂，介导药物主动靶向于肝脏组织；既能达到靶向识别结合肝癌细胞的目的，又能通过NK4阻断HGF/c‑Met信号通路活性，抑制肿瘤细胞生长，协同增强药物抗肿瘤效果。NK4介导的脂质体药物递送系统在肝肿瘤靶向治疗方面存在较大的应用潜力。

A liver targeting ligand and its application in lipid system

The invention discloses a liver targeting ligand and its application in lipid system agent. The ligand is a single chain antibody fragment obtained by hydrolysis of hepatocyte growth factor by trypsin, including N-terminal hairpin structure and four kringle structures, i.e. NK4 liver targeting ligand; NK4 liver targeting is NK4 protein molecule. The invention also uses the principle of specific binding of ligand NK4 and hepatocyte growth factor C \u2011 Met receptor, and uses single chain antibody fragment NK4 of HGF as liver targeting ligand to prepare NK4 surface modified liposome preparation, which can mediate the active targeting of drugs to liver tissue; it can not only achieve the purpose of targeting recognition of combined liver cancer cells, but also block the activity of HGF / C \u2011 met signal pathway through NK4, so as to inhibit the growth of tumor cells Long, synergistically enhance the anti-tumor effect of drugs. NK4 mediated liposome drug delivery system has great potential in targeted therapy of liver tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种肝靶向配体及其在脂质体制剂中的应用
本专利技术属于医药
，具体是一种新的肝靶向配体NK4及其在脂质体制剂中的应用。
技术介绍
肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是临床上一种常见且具有高度侵袭性的恶性癌症，发病率在全世界范围内排第5位，由于其预后差，死亡率排第3位。我国是肝癌高发地区，且发病率有上升趋势，但目前临床上缺乏安全、有效的抗肝癌药物或治疗手段。近年来，靶向药物治疗在肿瘤治疗领域取得了重大突破，脂质体（liposome）是一种靶向药物载体，属于靶向递药系统的一种新剂型。脂质体微粒给药系统具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以保护药物活性基团，延长药物的半衰期，经给药进入体内后，主要被网状内皮细胞所吞噬，被动靶向于肝脏等网状内皮系统。如果对脂质体表面进行修饰，如连接单克隆抗体，可使脂质体具有主动靶向性，从而进一步提高药物疗效，减少毒副作用。肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）是间质细胞（如成纤维细胞、巨噬细胞等）产生的细胞因子，作用于肿瘤细胞表面的受体c-Met蛋白。HGF/c-Met信号在促进肿瘤发生、侵袭、转移和肿瘤血管生成方面发挥重要作用，因此，HGF/c-Met可以作为抗肿瘤药物设计的靶标。其中，由HGF的α链N末端和4个Kringle区域所组成的NK4蛋白是HGF的特异性拮抗剂，NK4与Met受体结合，但未激活Met受体，从而竞争性抑制HGF诱导的Met受体激活，阻断HGF/c-Met系统的信号转导，抑制肿瘤的生成、侵袭及转移，还能不依赖HGF/c-Met抑制肿瘤血管的新生，促进肿瘤细胞的凋亡。ZhuY等人的研究发现，NK4可在体外抑制HGF介导的多种肿瘤细胞的生长发展，并可抑制裸鼠体内肿瘤的生长、侵袭和转移（ZhuY,ChengM,YangZ,etal.Mesenchymalstemcell-basedNK4genetherapyinnudemicebearinggastriccancerxenografts[J].DrugDesign,DevelopmentandTherapy,2014,8:2449-2462.）。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种新的肝靶向配体，该配体是肝细胞生长因子经胰弹力蛋白酶水解获得的单链抗体片段，包括N末端的发夹结构和4个Kringle结构，即为NK4肝靶向配体。所述NK4肝靶向为NK4蛋白分子。所述NK4肝靶向配体是抗体或抗体片段。所述NK4肝靶向配体结合于肝细胞上的肝细胞生长因子c-Met受体，其中Kringle是NK4与c-Met受体结合的关键部位。所述NK4肝靶向配体用于递送抗肿瘤药物靶向于肝细胞。NK4的结构如图1所示，NK4肝靶向配体的制备方法如下：采用密码子优化软件MaxCodonTMOptimizationProgram(V13)对提供的NK4蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将NK4基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到Top10克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导表达NK4蛋白，之后通过亲和层析（Ni-IDA树脂）纯化NK4蛋白。表达载体转化及诱导表达：将构建好的含有NK4基因的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上（含50μg/mL的硫酸卡那霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果：从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中（含50μg/mL的硫酸卡那霉素），待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mMIPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。160V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶利用蛋白凝胶快速处理系统染脱色。NK4蛋白放大培养：培养4L的表达菌，生长至OD600=0.8时，加终浓度0.2mMIPTG，15℃诱导16h后收集菌体。上清中亲和层析纯化NK4蛋白（整个纯化过程在低温下操作）：全菌采用50mMTris(pH8.0)，300mMNaCl，20mMImidazole含1%TritonX-100，1mMDTT，1mMPMSF超声裂解，同时以50mMTris(pH8.0)，300mMNaCl，20mMImidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。包涵体通过亲和层析纯化NK4蛋白：包涵体采用50mMTris(pH8.0)，300mMNaCl含1%TritonX-100，2mMEDTA，5mMDTT洗涤后，以50mMTris(pH8.0)，300mMNaCl，8MUrea，20mMImidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，检测情况如图2-5所示。经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的Lane4-11，下一步进行分子筛纯化。分子筛层析（SEC）纯化NK4蛋白：SEC柱型号：XK16/100SEC填料型号：Superdex200prepgrade流速：1.0mL/min纯化缓冲液：50mMTris(pH8.0)，300mMNaCl合并纯度相对高的Lane5-7，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液［50mMTris(pH8.5)，300mMNaCl，1MUrea］中复性，复性后NK4蛋白最终透析于储存液50mMTris(pH8.5)，300mMNaCl溶液约6-8h。透析结束后用0.22μm滤器过滤，并分装冻干得NK4。本专利技术另一个目的是提供了一种NK4修饰脂质体制剂，将NK4肝靶向配体修饰于脂质体表面；脂质体制剂由药物、卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、NK4组成，其中各组分比例为：药物与卵磷脂质量比为1∶5~30；胆固醇与卵磷脂质量比为1∶3~7；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺与卵磷脂质量比为1∶100~300；NK4与卵磷脂质量比为1∶100~1000。制备的NK4修饰脂质体制剂，该制剂载体可用于包载各种不同的抗肿瘤药物，以提高药物的肝靶向抗肿瘤效果。所述NK4修饰脂质体制剂的制备方法，包括如下步骤：（1）按脂质体制剂各组分的质量比称取药物、卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、NK4备用；（2）取药物、胆固醇、卵磷脂，将三者混合后加入氯仿溶解药物、胆固醇与卵磷脂，得类脂溶液；氯仿的加入量以能完全溶解药物、胆固醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝靶向配体，其特征在于：该配体是肝细胞生长因子经胰弹力蛋白酶水解获得的单链抗体片段，包括N末端的发夹结构和4个Kringle结构，即为NK4肝靶向配体。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝靶向配体，其特征在于：该配体是肝细胞生长因子经胰弹力蛋白酶水解获得的单链抗体片段，包括N末端的发夹结构和4个Kringle结构，即为NK4肝靶向配体。


2.根据权利要求1所述的肝靶向配体，其特征在于：所述NK4肝靶向为NK4蛋白分子。


3.根据权利要求1所述的肝靶向配体，其特征在于：所述NK4肝靶向配体是抗体或抗体片段。


4.根据权利要求1-3任一项所述的肝靶向配体，其特征在于：所述NK4肝靶向配体结合于肝细胞上的肝细胞生长因子c-Met受体，其中Kringle是NK4与c-Met受体结合的关键部位。


5.根据权利要求1-4任一项所述的肝靶向配体，其特征在于：所述NK4肝靶向配体用于递送抗肿瘤药物靶向于肝细胞。


6.一种NK4修饰脂质体制剂，其特征在于：将权利要求1所述的NK4肝靶向配体修饰于脂质体表面；
脂质体制剂由药物、卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、NK4组成，其中各组分比例为：药物与卵磷脂质量比为1∶5~30；胆固醇与卵磷脂质量比为1∶3~7；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺与卵磷脂质量比为1∶100~300；NK4与卵磷脂质量比为1∶100~1000。


7.根据权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴卫，周婷，唐欣，张玮，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：广西;45