一种兔单克隆抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG‑XMT

A preparation method of rabbit monoclonal antibody

The invention discloses a preparation method of rabbit monoclonal antibody, which comprises the following steps: Step 1, preparation of immune serum; step 2, affinity purification of antibody; step 3, mass spectrometry; step 4, acquisition of variable region gene spectrum of antibody; step 5, acquisition of monoclonal antibody; in step 1, heteromorphic rabbits with bas mutation and wild parent B9 are selected, and the The rabbits were inoculated subcutaneously with complete adjuvant, once every three days, three times in total. After two weeks of immunization, the same time was injected again. After one month of immunization, the rabbits were injected with ng \u2011 XMT via tail vein

【技术实现步骤摘要】
一种兔单克隆抗体制备方法
本专利技术涉及兔单克隆抗体制备
，具体为一种兔单克隆抗体制备方法。
技术介绍
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体，兔抗体库是兔源多克隆抗体和单克隆抗体非常优质的来源，产生的抗体拥有高特异性、高活性和高亲和力的优点，现有技术中的兔单克隆抗体制备都是通过杂交瘤技术，制备缓慢，不够高效，抗体亲和力不高，因此，设计一种兔单克隆抗体制备方法是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种兔单克隆抗体制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG-XMTTM蛋白，用无菌小试管收集免疫家兔血，标记后送准备室，以未免疫鼠血清作对照，以ELISA测定抗体效价，通过使用酶标仪测定OD490光吸收值定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性，当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，认定为阳性，选取阳性免疫血清；其中在上述的步骤二中，将蛋白AsepharoseCL-4B填料装柱，用洗脱缓冲液洗3~5个柱床体积洗掉乙醇和杂质，用平衡缓冲液流洗5~10个柱床体积平衡柱，血清样品上柱，均匀上样，可将流出液反复上样，用平衡缓冲液再洗5~10个柱床体积，直至基线趋于平缓，分别以相对快速和慢速加入洗脱缓冲液，pH降至约3.0，抗体从填料上洗脱下来，立即用上述中和缓冲液中和洗脱液至pH为中性，防止洗脱缓冲液的酸性环境引起抗体失活，得到样品；其中在上述的步骤三中，打开LC-ESI-MS/MS质谱仪，采用纳米流动液相色谱对待测的样品进行分离纯化，分离后的样品进入质谱仪，与串联质谱联用分析被消化的抗体组分；其中在上述的步骤四中，通过搜索免疫家兔B细胞免疫球蛋白库的下一代DNA序列建立的参考数据库，获得抗体可变区的高置信度肽谱匹配；其中在上述的步骤五中，从抗体可变区基因谱中选取CDR3序列及对应的重链和轻链抗体核酸序列作为候选配对序列，分别构建重链和轻链表达载体，混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到阳性组合，将阳性组合中的重链和轻链进行拆分，按照1条重链与1条轻链的原则配对，利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到的阳性组合即为与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。根据上述技术方案，所述步骤一中，注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。根据上述技术方案，所述步骤二中，平衡缓冲液为pH7.4，20mmol/L磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为pH2.8，0.1mol/L甘氨酸缓冲液，中和缓冲液为pH9.0，1mol/LTris-HCl缓冲液。根据上述技术方案，所述步骤一中，对免疫家兔血室温静置30min，2000rpm离心10分钟，吸取血清置1.5ml塑料管，做好标记。根据上述技术方案，所述步骤二中，缓冲液使用前均需经0.45μm滤膜过滤。根据上述技术方案，所述步骤一中，免疫注射剂量为50~100μg/只。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：利用蛋白质组学，通过抗原特异性，直接从免疫动物的循环血液中直接鉴定并克隆抗原特异性单克隆抗体，相比传统杂交瘤技术更高效、更快速，而且，制备的单克隆抗体具有高亲和力，能够应用于开发治疗疾病相关的人单克隆抗体，并帮助深入理解免疫学基础问题。附图说明图1是本专利技术的制备方法流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，本专利技术提供一种技术方案：一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG-XMT™蛋白，用无菌小试管收集免疫家兔血，标记后送准备室，以未免疫鼠血清作对照，以ELISA测定抗体效价，通过使用酶标仪测定OD490光吸收值定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性，当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，认定为阳性，选取阳性免疫血清；其中在上述的步骤二中，将蛋白AsepharoseCL-4B填料装柱，用洗脱缓冲液洗3~5个柱床体积洗掉乙醇和杂质，用平衡缓冲液流洗5~10个柱床体积平衡柱，血清样品上柱，均匀上样，可将流出液反复上样，用平衡缓冲液再洗5~10个柱床体积，直至基线趋于平缓，分别以相对快速和慢速加入洗脱缓冲液，pH降至约3.0，抗体从填料上洗脱下来，立即用上述中和缓冲液中和洗脱液至pH为中性，防止洗脱缓冲液的酸性环境引起抗体失活，得到样品；其中在上述的步骤三中，打开LC-ESI-MS/MS质谱仪，采用纳米流动液相色谱对待测的样品进行分离纯化，分离后的样品进入质谱仪，与串联质谱联用分析被消化的抗体组分；其中在上述的步骤四中，通过搜索免疫家兔B细胞免疫球蛋白库的下一代DNA序列建立的参考数据库，获得抗体可变区的高置信度肽谱匹配；其中在上述的步骤五中，从抗体可变区基因谱中选取CDR3序列及对应的重链和轻链抗体核酸序列作为候选配对序列，分别构建重链和轻链表达载体，混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到阳性组合，将阳性组合中的重链和轻链进行拆分，按照1条重链与1条轻链的原则配对，利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到的阳性组合即为与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。根据上述技术方案，步骤一中，注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。根据上述技术方案，步骤二中，平衡缓冲液为pH7.4，20mmol/L磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为pH2.8，0.1mol/L甘氨酸缓冲液，中和缓冲液为pH9.0，1mol/LTris-HCl缓冲液。根据上述技术方案，步骤一中，对免疫家兔血室温静置30min，2000rpm离心10分钟，吸取血清置1.5ml塑料管，做好标记。根据上述技术方案，步骤二中，缓冲液使用前均需经0.45μm滤膜过滤。根据上述技术方案，步骤一中，免疫注射剂量为50~100μg/只。基于上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其特征在于：/n其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG-XMT

【技术特征摘要】
1.一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其特征在于：
其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG-XMTTM蛋白，用无菌小试管收集免疫家兔血，标记后送准备室，以未免疫鼠血清作对照，以ELISA测定抗体效价，通过使用酶标仪测定OD490光吸收值定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性，当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，认定为阳性，选取阳性免疫血清；
其中在上述的步骤二中，将蛋白AsepharoseCL-4B填料装柱，用洗脱缓冲液洗3~5个柱床体积洗掉乙醇和杂质，用平衡缓冲液流洗5~10个柱床体积平衡柱，血清样品上柱，均匀上样，可将流出液反复上样，用平衡缓冲液再洗5~10个柱床体积，直至基线趋于平缓，分别以相对快速和慢速加入洗脱缓冲液，pH降至约3.0，抗体从填料上洗脱下来，立即用上述中和缓冲液中和洗脱液至pH为中性，防止洗脱缓冲液的酸性环境引起抗体失活，得到样品；
其中在上述的步骤三中，打开LC-ESI-MS/MS质谱仪，采用纳米流动液相色谱对待测的样品进行分离纯化，分离后的样品进入质谱仪，与串联质谱联用分析被消化的抗体组分；
其中在上述的步骤四中，通过搜索免疫家兔B细胞免疫球蛋白库的下一代DNA序列建立的参考数据库，获得抗体可变...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈黎娜，王睿，熊凯媛，周雪，
申请(专利权)人：福州精锐生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35