铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用。本发明专利技术从铁皮石斛类原球茎中克隆得到铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因DoLEA43，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。因此，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，特别是植物种质保存和利用愈伤组织产生活性物质等方面扮演者重要的角色。

Application of dolea43 in promoting callus formation of Dendrobium officinale

The invention discloses the application of dolea43, a late embryonic development abundant protein of Dendrobium candidum, in promoting the formation of plant callus. Dolea43, a coding gene of dolea43, a late embryonic development abundant protein of Dendrobium candidum, is cloned from the protocorm of Dendrobium candidum. Dolea43, a late embryonic development abundant protein of Dendrobium candidum, as a positive regulatory factor, participates in the formation of plant calli. Through transgene and functional identification, it is confirmed that the overexpression of dolea43, a late embryonic development abundant protein of Dendrobium candidum, is over expressed The callus induction rate increased. Therefore, dolea43, a protein rich in late embryonic development of Dendrobium officinale, or its coding gene, plays an important role in the process of plant tissue regeneration, especially in the preservation of plant germplasm and the production of active substances from callus.

【技术实现步骤摘要】
铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用
：本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用。
技术介绍
：植物种子在成熟过程中，体内储藏性物质含量增加，水分含量逐渐降低，在种子的子叶或者胚乳中积累一些可溶性的糖类和蛋白质等，作为能量存储或者增强种子的脱水耐性(Angelovicietal.2010；Leprinceetal.2017)。脱水耐性是种子对低含水量或脱水的忍耐程度，种子在成熟过程中进行脱水，在这一过程合成大量的亲水物质，维持细胞结构，防止质膜损害和重要蛋白变性等，从而减少种子脱水对细胞造成的伤害。1981年首次发现了棉花种子中高丰度的胚胎发育晚期丰富蛋白(Lateembryogenesisabundantprotein，LEA)，随后在其它的物种如大豆(Glycinemax，Linetal.2004；LiuandZheng2005)、玉米(ZeamaysL.，Campbelletal.1998)、水稻(OryzasativaL.，Xiaoetal.2007)和烟草(Nicotianarustica，RoyChoudhuryetal.2007)等植物中也发现了LEA蛋白。LEA家族蛋白相对分子质量较小，一般为10-30kDa，小部分大于30kDa，是一类富含赖氨酸和甘氨酸等亲水性氨基酸的亲水性的蛋白(Bakeretal.1988；Battagliaetal.2008))。研究表明，LEA受ABA和水分胁迫诱导(Moonsetal.1997；Zegzoutietal.1997)，在逆境胁迫情况下，可能起到保护植物细胞结构、维持内环境稳定的作用。越来越多研究表明LEA参与植物各种非生物逆境胁迫，如干旱(Yuetal.2016)、盐胁迫(Choureyetal.2003；Xuetal.1996))和冷胁迫等(NDongetal.2002；Suttonetal.1992)。但LEA蛋白的其它功能如促进愈伤组织的形成未有报道。在植物离体培养中，受到一些因素的刺激，植物细胞脱分化，并进一步增殖形成具有再生能力的细胞团，即愈伤组织。愈伤组织不仅是遗传转化、研究植物基因功能的重要材料，同时也是植物组织快繁的关键材料。此外，愈伤组织在植物种质保存和利用愈伤组织生产活性物质等方面扮演着重要的角色。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在促进植物愈伤组织形成中的应用。本专利技术所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的促进植物愈伤组织形成优选为促进植物下胚轴愈伤组织形成。所述的植物优选为拟南芥。本专利技术从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白家族LEA_1亚家族的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。因此，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，特别是植物种质保存和利用愈伤组织产生活性物质等方面扮演者重要的角色。附图说明：图1是DoLEA43基因全长；其中M为DL2000DNAMarker，1为目的片段。图2是pCAMBIA1302植物双元表达载体图。图3是半定量PCR证明DoLEA43基因可在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)中正常转录；其中WT为野生型拟南芥，Line2、Line4和Line6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。图4是Westernblot证明DoLEA43蛋白可在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)中正常表达；其中WT为野生型拟南芥，Line2、Line4和Line6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。图5是野生型拟南芥和DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)的愈伤组织诱导率；其中WT为野生型拟南芥，Line2、Line4和Line6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。图6是野生型拟南芥和DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)愈伤组织图片；其中WT为野生型拟南芥，Line2、Line4和Line6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：DoLEA43基因的全长克隆下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。实施例中所用铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)从福建冠豸山收集得到，其种子无菌播种后得到的原球茎进一步增殖获得类原球茎，该类原球茎作为种质资源保存于中国科学院华南植物园的组培室内，培养在1/2MS+0.1％活性炭+2％蔗糖+0.2％琼脂粉PH5.4的培养基上，在26±1℃，40μmolm-2s-1，12-h光照/12-h黑暗，60％相对湿度的培养室中。逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；DNaseI(RNaseFree)购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号为D2215；普通PCR反应buffer为2×TSINGKEMasterMix(blue)购自擎科生物公司，其货号为TSE004-5ML；构建超表达载体采用高保真酶进行扩增，所用的高保真酶为KOD-401，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，其货号为：KOD-401；pMD18-T载体和NcoI酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号分别为D101A和1160BH；MS和LB培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》；1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。以SDS法提取铁皮石斛类原球茎RNA，提取得到的RNA用DNaseI进行去基因组DNA处理，具体操作按照使用说明书进行。得到的纯化后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；然后在超微量核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，检测合格的RNA置于-80本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在促进植物愈伤组织形成中的应用；所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在促进植物愈伤组织形成中的应用；所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白D...

【专利技术属性】
技术研发人员：段俊，何春梅，俞振明，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44