一种人工合成信号肽制造技术

技术编号:22559794 阅读:108 留言:0更新日期:2019-11-16 09:29
本发明专利技术属于生物技术领域,公开了一种人工合成信号肽。具体地,本发明专利技术涉及一条用于引导外源蛋白在哺乳动物细胞高分泌表达的信号肽,所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,此信号肽加在蛋白的氨基酸序列前,用于引导外源蛋白在哺乳动物细胞的分泌表达,此信号肽相比其它常用信号肽可大幅度提高蛋白在哺乳动物细胞中的表达量。

A synthetic signal peptide

The invention belongs to the field of biotechnology and discloses an artificial synthetic signal peptide. Specifically, the present invention relates to a signal peptide for guiding the highly secreted expression of foreign protein in mammalian cells. The amino acid sequence of the signal peptide is shown in SEQ ID No: 6. The signal peptide is added in front of the amino acid sequence of the protein to guide the secretion and expression of foreign protein in mammalian cells. Compared with other commonly used signal peptide, the signal peptide can greatly improve the protein in lactation The amount of expression in the cell.

【技术实现步骤摘要】
一种人工合成信号肽
本专利技术涉及生物
,具体涉及一种人工合成信号肽,特别涉及一种用于引导外源蛋白在哺乳动物细胞分泌表达的人工合成信号肽。
技术介绍
根据汤姆森路透最新数据,全球已上市或者进入到三期临床的蛋白药物有243个,其中121个已经获得美国FDA批准,以肿瘤和自身免疫性疾病用药为主,在眼科疾病、呼吸性系统疾病、抗感染领域也有多个品种的应用。预计2018年全球蛋白药物市场的规模已经超过1000亿美元。哺乳动物细胞表达蛋白的一个突出特点是表达水平低,近年来,随着分子生物学、细胞生物学的发展,对提高蛋白表达量也进行了一系列的研究,包括载体的设计,细胞株的改造,发酵条件的优化,发酵培养基优化,补料方式的优化等。其中载体改造方面已经做了很多工作,包括适当的启动子、增强子、加尾信号、信号肽的选择均能在一定水平上提高CHO细胞的蛋白表达量。不同的信号肽诱导的蛋白的表达量不同,选择合适的信号肽可以提高蛋白的表达量。信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链,位于分泌蛋白的N端,可被剪切,一般由15-30个氨基酸前导序列组成,包括三个区:带正电的N末端,有2-3个极性氨基酸,称为碱性氨基末端;中间由很多的疏水氨基酸构成疏水序列,它是信号肽的主要功能区;一个较长的带负电荷的C末端,是信号序列切割位点,也称加工区。当信号肽序列合成后,被信号识别颗粒(SRP)所识别,蛋白质合成暂停或减缓,信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上,蛋白质合成重新开始,在信号肽的引导下,新合成的蛋白质进入内质网腔,而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。信号肽足以将任何附加的多肽转运至靶膜,不同蛋白在哺乳动物细胞中表达,需要不同的信号肽,同一种蛋白在不同信号肽的作用下,即使都能分泌表达,其分泌效率也会相差甚远,选择合适的信号肽,可以提高蛋白的分泌表达量。对于分泌蛋白,选择合适的信号肽可以将其表达量成倍提高,无论对于工业生产还是科学研究,都具有非常深远的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的,在于提供一种人工合成信号肽,具体来说一种可以引导外源蛋白质高效表达的信号肽,以降低外源蛋白的生产成本。本专利技术提供了一种人工合成的用于引导外源蛋白质在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。所述信号肽氨基酸序列如SEQIDNO:6所示,具体序列如下:MGKLIFWLVFWLTIFWLGSA。所述的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary,CHO),BHK,HEK293细胞或SP2/0细胞。本专利技术还提供了一种外源GLP-1-Fc融合蛋白、FGF21细胞因子、PD-1抗体、抗CD20抗体分泌表达的方法,其特征在于,使用如SEQIDNO:6所示的信号肽。本专利技术还提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码所述用于引导外源蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。进一步的,所述多核苷酸序列如SEQIDNO:12所示,具体序列如下:ATGGGCAAACTCATATTCTGGCTTGTGTTTTGGCTGACTATTTTTTGGCTTGGATCAGCT。本专利技术的多核苷酸可通过常规的化学合成等方法制备。本专利技术的多核苷酸可添加于哺乳动物细胞表达载体,用于引导外源蛋白的分泌表达。利用本专利技术的信号肽在哺乳动物细胞中分泌表达蛋白质的方法:将编码本专利技术信号肽的多核苷酸与编码表达蛋白质的多核苷酸连接后克隆入哺乳动物细胞表达载体,而后将该重组哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物细胞后表达目的蛋白。本专利技术还提供了一种哺乳动物细胞表达载体,所述表达载体含有前述编码本专利技术信号肽的多核苷酸及编码目的蛋白质的多核苷酸。所述多核苷酸紧接在所述编码哺乳动物来源蛋白质的多核苷酸前端。在一个实施例中,表达融合蛋白所采用的载体为FreedompCHO1.0,合成并构建信号肽质粒,提取质粒后用限制性内切酶AvrⅡ和BstZ17Ⅰ双酶切,进行凝胶电泳,回收目的片段,将信号肽的目的序列克隆入AvrⅡ和BstZ17Ⅰ的酶切位点。含有信号肽和目的蛋白的表达载体转染宿主细胞并表达目的蛋白。在另一个实施例中,表达细胞因子所采用的载体为FreedompCHO1.0,合成并构建信号肽质粒,提取质粒后用限制性内切酶AvrⅡ和BstZ17Ⅰ双酶切,进行凝胶电泳,回收目的片段,将信号肽的目的序列克隆入AvrⅡ和BstZ17Ⅰ的酶切位点。含有信号肽和目的蛋白的表达载体转染宿主细胞,并表达目的蛋白。所述的载体还可以是PXC17.4、pCDNA3.3、pCMV3等表达载体,表达目的蛋白效果与载体FreedompCHO1.0相近。在另一个实施例中,表达抗体所用的载体为pCDNA3.3,合并并构建含信号肽质粒,测序鉴定后,表达载体转染宿主细胞,并表达目的蛋白。所述表达载体的启动子为EF-1α启动子,hCMV启动子,SV40启动子或EF-1α与hCMV启动子的杂合启动子。本专利技术还提供了一种哺乳动物宿主细胞,所述宿主细胞为前述表达载体所转染。所述的哺乳动物细胞可选自CHO,BHK,HEK293或SP2/0。本专利技术还提供一种哺乳动物外源蛋白的制备方法,在适合表达哺乳动物外源蛋白质的条件下,培养哺乳动物宿主细胞,而后从培养物中分离出所述哺乳动物外源蛋白质。本专利技术的信号肽可用于融合蛋白、细胞因子或抗体的分泌表达。在一个优选的实施例中,将编码氨基酸序列如SEQIDNO:6所示信号肽的多核苷酸与编码GLP-1-Fc的多核苷酸连接后克隆入表达载体FreedompCHO1.0,而后将该重组哺乳动物细胞表达载体转染Gibico公司的CHO-S细胞表达目的蛋白。结果表明,本专利技术信号肽与GLP-1-Fc融合蛋白原有信号肽humanalbumin进行比较,本专利技术的信号肽可使得GLP-1-Fc融合蛋白的分泌表达量从785.8ug/ml提高到了4813.3ug/ml,提高了6.12倍。本专利技术的信号肽可使融合蛋白的表达量大幅度提高。在一个更优的实施例中,首先,使用SEQIDNO:6所示信号肽的多核苷酸构建重组pCHO1.0表达载体:由上海生物工程有限公司合成并构建信号肽质粒puc57-GLP-1-Fc-6,小量提取质粒后,用限制性内切酶AvrⅡ、BstZ17Ⅰ双酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳,胶回收目的片段。将目的片段与同样经限制性内切酶AvrⅡ、BstZ17Ⅰ双酶切的真核表达载体pCHO1.0连接,构建重组真核表达载体pCHO1.0-GLP-1-Fc-6,转化大肠杆菌E.coliDH5α,过夜培养后挑取阳性克隆进行小量质粒提取,限制性内切酶AvrⅡ、BstZ17Ⅰ双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定,将鉴定阳性的克隆送上海生物工程有限公司测序,选择测序正确的克隆进行大量质粒提取。然后用限制性内切酶NruI线性化,乙醇沉淀法回收质粒,95℃加热15min除菌,室温冷却后,-20℃保存备用。其次,上述重组表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S细胞)并表达目的蛋白:采用脂质体法(FreestyleMAX,invi本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种人工合成信号肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人工合成信号肽,其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。


2.一种外源GLP-1-Fc融合蛋白、FGF21细胞因子、PD-1抗体、抗CD20抗体分泌表达的方法,其特征在于,使用如SEQIDNO:6所示的信号肽。


3.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码权利要求1所述的信号肽。


4.根据权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸的序列如SEQID:12所示。


5.一种哺乳动物细胞表达载体,所述表达载体含有权利要求3或4所述多核苷酸及编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸。


6.根据权利要求5所述的哺乳动物细胞表达载体,其特征在于,权利要求3或4所述多核苷酸紧...

【专利技术属性】
技术研发人员:张贵民朱中松赵丽丽
申请(专利权)人:鲁南制药集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:山东;37

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1
相关领域技术
  • 暂无相关专利