一种香豆素类半胱氨酸荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种香豆素类半胱氨酸荧光探针及其制备方法与应用，涉及荧光分子探针领域。本发明专利技术的制备方法包括以7‑羟基香豆素为原料合成中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛，再以中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛为原料合成香豆素类半胱氨酸荧光探针。本发明专利技术荧光探针对含有巯基(－SH)的氨基酸，尤其是Cys有专一的选择性，与其他常见氨基酸荧光信号基本没有变化，灵敏度高，检测限低。本发明专利技术的香豆素类荧光探针可应用于在半胱氨酸的体外荧光检测。

A coumarin cysteine fluorescent probe and its preparation and Application

The invention relates to a coumarin cysteine fluorescent probe, a preparation method and application thereof, and relates to the field of fluorescent molecular probes. The preparation method of the invention includes the synthesis of intermediate 7 \u2011 hydroxy \u2011 8 \u2011 coumarin aldehyde from 7 \u2011 hydroxy coumarin, and the synthesis of coumarin cysteine fluorescent probe from intermediate 7 \u2011 hydroxy \u2011 8 \u2011 coumarin aldehyde. The fluorescent probe of the invention has specific selectivity for amino acids containing sulfhydryl (- SH), especially Cys, basically unchanged with other common amino acids, high sensitivity and low detection limit. The coumarin fluorescent probe of the invention can be used for in vitro fluorescence detection of cysteine.

【技术实现步骤摘要】
一种香豆素类半胱氨酸荧光探针及其制备方法与应用
本专利技术属于荧光分子探针领域，特别是涉及一种香豆素类半胱氨酸荧光探针及其制备方法与应用。
技术介绍
半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是一种含巯基(-SH)的氨基酸，参与了细胞内氧化还原反应等多种信号传导过程，在生理和病理过程中都扮演着十分重要的作用。其中，Cys与机体的解毒作用、新陈代谢和蛋白质合成有着密切的联系，而异常的Cys含量可能引起各种疾病，例如：造血功能缺失、生长缓慢、脱失水肿、肝脏损伤、肌肤损害等疾病。因此，有效检测或监控生物样品或环境样品中的Cys已成为近年来相关领域的研究热点。但是由于其结构都含有巯基(-SH)，很难将Cys/Hcy与GSH区分开。因为体内Cys的含量是Hcy含量的十倍以上，所以目前主要集中于Cys的检测。目前很多分析方法已被用来测定Cys，如高效液相色谱法、毛细管电泳法、紫外检测法、质谱法、荧光探针检测法等。尽管这些方法的灵敏度比较高，但都具有检测成本高、样品前处理复杂、费时，不适用于实时和现场检测等缺点。由于荧光探针在选择性、检测成本等方面具有绝对的优势，目前设计和使用荧光探针来检测半胱氨酸，引起了分析工作者的广泛关注，因此，开发一种能够高选择性、高灵敏度、快速便捷地检测Cys的方法对一些重大疾病的初期临床诊断具有十分重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种香豆素类半胱氨酸荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针合成简单，结构新颖，应用于体外检测Cys，具有较好的选择性、灵敏性、检测限低等优点。本专利技术提供了一种香豆素类半胱氨酸荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：本专利技术还提供了一种上述香豆素类半胱氨酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，反应，得到如式(Ⅰ’)所示结构的第一中间产物；S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，反应，得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；S3.将所述第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应，得到所述香豆素类半胱氨酸荧光探针。优选的，步骤S1中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比为1：(0.55～0.7)。优选的，步骤S1中所述反应的温度为70～100℃，反应时间为6～8h。优选的，步骤S2中所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比为1：(1～1.2)：(0.86～1)。优选的，步骤S2中所述反应的温度为110-120℃，反应时间为1～3h。优选的，所述第二中间产物、丙烯酰氯以及三乙胺的摩尔比为1:(1～1.5)：(10～11.5)。优选的，步骤S3中所述反应的温度为0～25℃，反应时间为3～5h。本专利技术还提供了前述香豆素类半胱氨酸荧光探针或上述制备方法得到的香豆素类半胱氨酸荧光探针在半胱氨酸的体外荧光检测中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术荧光探针具有香豆素荧光团，该探针中的丙烯酸酯基团与Cys之间发生共轭加成反应生成显色团，将通过ESIPT过程很快恢复至on-state状态，实现了对半胱氨酸的荧光识别，检测灵敏度高。2.本专利技术荧光探针对半胱氨酸有较好的选择性，与其他常见氨基酸作用荧光信号基本没有变化，较高的抗干扰能力，反应时间较短，有较大的斯托克斯位移，检测限低。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对应本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图得到其他的附图。图1为本专利技术实施例1中第一中间产物的1H-NMR谱图；图2为本专利技术实施例1中第二中间产物的1H-NMR谱图；图3为本专利技术实施例1中香豆素类半胱氨酸荧光探针的1H-NMR谱图；图4为本专利技术实施例2中香豆素类半胱氨酸荧光探针对半胱氨酸选择性识别的荧光发射光谱图；图5为本专利技术实施例3中香豆素类半胱氨酸荧光探针在不同浓度半胱氨酸存在下荧光发射光谱变化图；图6为本专利技术实施例4中香豆素类半胱氨酸荧光探针在半胱氨酸及其他氨基酸存在下的荧光发射强度变化图；图7为本专利技术实施例5中香豆素类半胱氨酸荧光探针对半胱氨酸的检测限计算图；图8为本专利技术实施例6中香豆素类半胱氨酸荧光探针在不同pH下的荧光发射强度变化图；图9为本专利技术实施例7中香豆素类半胱氨酸荧光探针在不同时间下的荧光发射强度变化图。具体实施方式本专利技术提供了一种香豆素类半胱氨酸荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：该香豆素类半胱氨酸荧光探针属于反应型荧光探针，分子结构中丙烯酸酯基团与Cys之间发生共轭加成反应生成显色团，实现了对Cys的荧光识别，检测灵敏度高。上述香豆素类半胱氨酸荧光探针的制备方法如下：S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，反应，得到如式(Ⅰ’)所示结构的第一中间产物；S2.将第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，反应，得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；S3.将第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应，得到所述香豆素类半胱氨酸荧光探针。本专利技术香豆素类半胱氨酸荧光探针的制备可采用以下反应式表示：具体的，本专利技术首先将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，反应，得到第一中间产物7-羟基-8-香豆素醛，本专利技术中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比优选为1：(0.55～0.7)，更优选为1:0.55，反应温度优选为70～100℃，反应时间优选为6～8h。得到第一中间产物7-羟基-8-香豆素醛后，将7-羟基-8-香豆素醛、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，反应，得到第二中间产物8-(苯并[d]噻唑-2-基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮，本专利技术中第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(0.86～1)，更优选为1：1：0.86，反应的温度优选为110-120℃，反应时间优选为1～3h。得到第二中间产物8-(苯并[d]噻唑-2-基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮后，将第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应，得到香豆素类半胱氨酸荧光探针。本专利技术中第二中间产物、丙烯酰氯以及三乙胺的摩尔比优选为1:(1～1.5)：(10～11.5)，更优选为1:1:11.2。本专利技术通过将第二中间产物中可产生激发态分子内质子转移(excited-stateintramolecularprotontransfer，ESI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香豆素类半胱氨酸荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种香豆素类半胱氨酸荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：





2.一种权利要求1所述香豆素类半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，反应，得到如式(Ⅰ’)所示结构的第一中间产物；



S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，反应，得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；



S3.将所述第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应，得到所述香豆素类荧光探针。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比为1：(0.55～0.7)。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤艳峰，王纯，孙同明，王淼，王敏敏，王金，邹逢霞，沈璐婕，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32