一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用技术

技术编号:22559694 阅读:34 留言:0更新日期:2019-11-16 09:26
本发明专利技术公开了一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用,其结构式如式I所示:

A photoregulated tyrosinase fluorescence probe and its preparation and Application

The invention discloses a light controlled tyrosinase fluorescence molecular probe, a preparation method and application thereof, and the structural formula is shown in formula I:

【技术实现步骤摘要】
一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用
本专利技术属于分析检测和分子成像领域,具体涉及一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用。
技术介绍
酪氨酸酶是一种含有铜的氧化还原酶,在动物、植物以及微生物中分布广泛,对于人体来说,无法从外界摄入络氨酸酶只能通过自身来合成,它对生物体的生理功能的发挥起着至关重要的作用,参与黑色素的合成过程。黑色素细胞广泛分布于眼睛、毛囊和皮肤之中。通过酪氨酸酶的催化作用来维持人体正常的生理功能,当酪氨酸酶过多或过少时,常常会引发很多疾病,如白化病、黑色素瘤、皮肤病和帕金森病等。虽然无法从食物中获取酪氨酸酶,但可以从外界获取酪氨酸进入人体,通过一系列转化后变为黑色素,从而起到补充黑色素的作用。黑色素的合成过程如下:首先酪氨酸酶通过催化酪氨酸,在其中引入羟基从使酪氨酸变成一种新物质多巴,随后经过氧化作用,氧化多巴使其进一步转化变为多巴醌,最后经过一系列其他反应生成黑色素。这些黑色素分别进入皮肤和毛发细胞中,赋予我们的皮肤和毛发颜色,从而保护皮肤细胞中的DNA和眼睛,防止它们受到紫外线辐射,并且它还能去除活性氧(ROS)防止体内组织出现过热的状况。由此可见,酪氨酸酶的检测具有十分重要的意义。然而,目前现有的检测酪氨酸酶荧光探针进入细胞后不可控制,导致时空分辨率不高。从而缺少研究一种具有高分辨率检测细胞内酪氨酸酶的方法。因此,发展一种光控的检测酪氨酸酶的荧光探针是非常有必要的。该探针只有在光和酪氨酸酶同时存在情况下,才能产生荧光信号。试卤灵因其具有长的波长和良好的稳定性而被广泛应用于生物分析中,而基于试卤灵检测酪氨酸酶的光控具有高分辨率的荧光探针尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种光控酪氨酸酶荧光分子探针。本专利技术所提供的这种探针,其结构式如下:所述的一种光控酪氨酸酶荧光分子探针的具体合成路线,如下所示:具体包括以下步骤:以丙酮为反应溶剂,碳酸钾和反应物1在氮气保护,0℃条件下反应45分钟,然后加入2-硝基溴苄,在氮气保护,室温条件下反应16h,用水和盐水洗涤,再用乙酸乙酯萃取4-5次,萃取液用无水硫酸镁干燥1小时,浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到化合物2。以二氯甲烷为反应溶剂,化合物2和三溴化磷在氮气保护,0℃条件下反应2小时,用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤,再用二氯甲烷萃取4-5次,萃取液用无水硫酸镁干燥1小时,浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到化合物3。以N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂,试卤灵和碳酸钾在氮气保护,室温条件下反应10分钟,然后加入化合物3,在氮气保护,60℃条件下反应24h,用盐水洗涤,再用乙酸乙酯萃取4-5次,萃取液用无水硫酸镁干燥1小时,浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到光控酪氨酸酶荧光分子探针Probe。其中:反应物1为3-羟基苯甲醇,化合物2为(3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇,化合物3为1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯。反应物1和2-硝基溴苄摩尔比为1:2,反应溶剂体积为10mL,所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶,化合物2的分离提纯所用的柱色谱的流动相为石油醚-乙酸乙酯的混合液,体积比为(3-100):1;化合物2和三溴化磷摩尔比为1:2,反应溶剂体积为10mL,所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶,所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶,化合物3的分离提纯所用的柱色谱的流动相为石油醚-乙酸乙酯的混合液,体积比为(5-100):1;化合物3和试卤灵摩尔比为2:1,反应溶剂体积为15mL,所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶,光控酪氨酸酶荧光分子探针Probe的分离提纯所用的柱色谱的流动相为二氯甲烷-甲醇的混合液,体积比为(40-100):1。本专利技术具有如下的技术效果,探针合成步骤简单,容易分离提纯;其激发和发射光谱在可见光区,化学稳定性好;探针进入细胞后可控,具有高时空分辨率。因此该专利技术方法具有良好的社会价值和应用前景。附图说明图1光控酪氨酸酶荧光探针合成路线图。图2(A)20µM探针与其响应400u/mL酪氨酸酶吸收光谱图;(B)100nM探针与其响应190u/mL酪氨酸酶荧光光谱图。图3光控酪氨酸酶荧光探针对紫外光照时间的考察。图4紫外光照5h的100nM探针对不同浓度酪氨酸酶的荧光响应图。图5紫外光照5h的100nM探针与不同浓度酪氨酸酶响应动力学曲线图。图6光控酪氨酸酶荧光探针选择性考察。图7酪氨酸酶抑制剂曲酸对酪氨酸酶抑制效果的考察。图8光控酪氨酸酶荧光探针细胞毒性试验考察。图9紫外光照5h的5µM探针分别用于B16、MCF-7和Hela细胞的共聚焦成像图。图105µM探针分别用于正常培养的B16细胞以及预先与抑制剂孵育过的B16细胞的共聚焦成像图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明,但不限于此。实施例1:光控酪氨酸酶荧光探针的合成,合成路线如图1所示,基本操作过程如下。(1)化合物2的合成:将碳酸钾(445.3mg,3.2222mmol)与反应物1(3-羟基苯甲醇)(200mg,1.6111mmol)依次加入到装有无水丙酮(15mL)的烧瓶(100mL)中,在氮气保护,0℃条件下反应45分钟,然后加入2-硝基溴苄(696.1mg,3.2222mmol),在氮气保护,室温条件下反应16h。反应完成后,用水和盐水洗涤,收集有机相,用乙酸乙酯萃取4-5次,待萃取完成后,往所收集的有机相中加入过量的无水硫酸镁干燥1小时,抽滤除去硫酸镁,减压蒸馏得到粗产物。用硅胶柱色谱提纯,得到最终产物固体355.4mg,产率为85.1%。(2)化合物3的合成:将化合物2((3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇)(455.mg,1.7565mmol)与三溴化磷(950.9mg,3.513mmol)依次加入到装有无水二氯甲烷(10mL)的烧瓶(100mL)中,在氮气保护,0℃条件下反应2小时。反应完成后,用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤,收集有机相,用二氯甲烷萃取4-5次,待萃取完成后,往所收集的有机相中加入过量的无水硫酸镁干燥1小时,抽滤除去硫酸镁,减压蒸馏得到粗产物。用硅胶柱色谱提纯,得到最终产物白色粉末固体236.6mg,产率为41.8%。(3)光控酪氨酸酶荧光探针的制备:将试卤灵(100mg,0.4691mmol)与碳酸钾(129.7mg,0.9382mmol)依次加入到装有无水N,N-二甲基甲酰胺(15mL)的烧瓶(100mL)中,在氮气保护,室温条件下反应10分钟,然后加入化合物3(1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯)(302.3mg,0.9382mmol),在氮气保护,60℃条件下反应24h。反应完成后,用水盐水洗涤,收集有机相,用乙酸乙酯萃取4-5次,待萃取完成后,往所收集的有机相中加入过量的无水硫酸镁干燥1小时,抽滤除去硫酸镁,减压蒸馏得到粗产物。用硅胶本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种光控酪氨酸酶荧光分子探针,其结构式如式I所示:/n

【技术特征摘要】
1.一种光控酪氨酸酶荧光分子探针,其结构式如式I所示:

(式I)。


2.根据权利要求1所述的一种光控酪氨酸酶荧光分子探针的制备方法,其特征在于,它如下步骤:
以N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂,式Ⅱ试卤灵和碳酸钾在氮气保护,室温条件下反应10分钟,然后加入1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯,在氮气保护,60℃条件下反应24h,用盐水洗涤,再用乙酸乙酯萃...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨盛蒋家兴杨荣华
申请(专利权)人:长沙理工大学
类型:发明
国别省市:湖南;43

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