温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法技术

本发明专利技术提供了一种温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法，包括温度敏感培养皿的包被预处理、心脏组织处理、心肌球培养、心肌球的收集与接种、CDC细胞的收集与保存、CDC心脏膜性贴片制备、CDC心脏膜性贴片获取、CDC心脏膜性贴片再培养等步骤，本发明专利技术是基于细胞膜性贴片技术，利用温度敏感型培养皿获得人心肌球源性干细胞膜性贴片，避免了细胞收获时消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时细胞膜蛋白的损伤，使细胞发生功能障碍或功能缺失，减弱干细胞在治疗医学上的应用潜能，并能使细胞与细胞外基质蛋白无损共同脱附培养皿，从而有效的保护了细胞膜蛋白和其相关受体，保证了细胞的生理功能和更强的功能特性。

A method of preparing human cardiac myocyte derived stem cell membrane patch in a temperature sensitive culture dish

The invention provides a method for preparing the membrane patch of human cardiac myocyte derived stem cells in a temperature sensitive culture dish, including the steps of coating pretreatment of the temperature sensitive culture dish, heart tissue treatment, cardiac myocyte culture, collection and inoculation of cardiac myocytes, collection and preservation of CDC cells, preparation of CDC cardiac membrane patch, acquisition of CDC cardiac membrane patch, and re culture of CDC cardiac membrane patch The invention is based on the cell membrane patch technology, uses the temperature sensitive culture dish to obtain the human cardiac myospheric stem cell membrane patch, avoids the cell membrane protein damage when digesting pancreatin and dispersing enzyme to digest the cell during cell harvest, causes cell dysfunction or function loss, weakens the application potential of stem cells in the treatment medicine, and enables cell and extracellular Matrix proteins can be desorbed together without damage to the culture dish, thus effectively protecting the membrane proteins and their related receptors, ensuring the physiological function and stronger functional characteristics of cells.

【技术实现步骤摘要】
温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法
本专利技术涉及干细胞再生医学
，尤其涉及一种温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法。
技术介绍
心力衰竭是各种心脏病终末期的临床综合征，也是一种全球性疾病，急性心肌梗死和心衰导致的死亡占心血管病总死亡人数的50％以上，社会的老龄化也促使这一问题更加严重，多年来临床治疗心衰的药物研究未见重大进展，未来心血管疾病的治疗领域还有很多挑战。当前，干细胞治疗技术是被认为最有希望和最具前景价值的理想治疗手段，目前临床多采用：1、干细胞注射到患处或经动静脉输注干细胞。注射过程中会造成大量干细胞丢失，部分干细胞随血液循环到达其它位置,而真正能够达到损伤部位的很少。2、将干细胞先附着在生物支架上生长，然后移植到患处。植入体内的支架可能会引起生物相容性的炎性反应，支架降解造成组织纤维化等的副作用。另外，在细胞的输注方式和应用细胞的选择上各不相同，如何使移植至体内的细胞能够聚集在病灶发挥更大作用也成为目前急需解决的问题。1993年日本学者okano等率先报道细胞膜性贴片技术，该技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密膜性贴片组织，能有效地修复组织缺损和改善器官功能，本专利技术是基于该技术，提出利用温度敏感型培养皿获得人心肌球源性干细胞膜性贴片，为解决上述问题提供了有效手段。
技术实现思路
本专利技术为解决上述技术问题提供了一种温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法，具体为：包括以下步骤：步骤a、心脏组织处理：心脏组织在无菌条件下剪切并用胰蛋白酶消化，将消化后的心脏组织再次进行无菌剪切后接种于细胞培养皿中，加入少量CEM培养基，细胞培养箱中培养24小时后补充CEM培养基，之后每两天进行换液；步骤b、心肌球培养：将步骤a中的心脏组织进行7-10天的培养，用胰蛋白酶消化心脏组织来源原代细胞，将细胞密度调整为1×105/ml后接种于24孔板中，每孔300uL，培养3-7天得到心肌球；步骤c、心肌球的收集与接种：用培养基反复轻轻吹打使心肌球悬浮，收集于离心管中离心，将收获的心肌球接种于细胞培养瓶中；步骤d、CDC细胞的收集与保存：接种于细胞培养瓶中的心肌球贴壁后会逐渐向周围爬出大量的CDC细胞，当CDC细胞生长达到80％-90％融合率后即可进行细胞传代，传代后的CDC细胞(P1)冻存于液氮中；步骤e、CDC心脏膜性贴片制备：将步骤d收集到的CDC细胞经消化酶消化，按照2×106个-3×108个/ml细胞的浓度将CDC细胞接种于温度敏感培养皿，在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；步骤f、CDC心脏膜性贴片获取：将步骤e培养得到的接种CDC细胞的温度敏感培养皿，在超净工作台中吸弃培养基，加入4℃预冷的膜性贴片清洗液a，将完全剥离温度敏感培养皿的CDC细胞膜性贴片移至普通培养皿中；步骤g、CDC心脏膜性贴片再培养：将步骤f中得到的CDC细胞膜性贴片在普通培养皿中滴加200μl-500μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养，取出后加入膜性贴片清洗液b洗膜性贴片n次，n≥2；优选的，在步骤a中，所述细胞培养皿用纤维粘连蛋白包被过优选的，在步骤b中，所述24孔板用多聚赖氨酸包被过优选的，在步骤c中，所述细胞培养瓶用纤维粘连蛋白包被过；进一步的，在步骤e中，预先对温度敏感培养皿进行包被处理：温度敏感培养皿中加入包被液，在37℃，5％CO2的培养箱中进行无菌包被；优选的，包被液为100％胎牛血清；优选的，包被液为细胞完全培养基；进一步的，细胞完全培养基包括IMDM、FBS、L-谷氨酰胺、双抗、BME；进一步的，步骤e中的CDC细胞培养时间为8-24小时；进一步的，步骤f中的膜性贴片清洗液a为HBSS+液或PBS液；进一步的，步骤f中的膜性贴片清洗液b为HBSS-液或PBS液。本专利技术通过细胞膜性贴片技术，将人心肌球源性干细胞按照特定的细胞浓度接种培养在具有温度应答的培养皿中，能够有效解决以下技术问题：1、避免了细胞收获时消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时细胞膜蛋白的损伤，使细胞发生功能障碍或功能缺失，减弱干细胞在治疗医学上的应用潜能；2、采用这种通过降温回收细胞的方式，可以使细胞与细胞外基质蛋白无损共同脱附培养皿，从而有效的保护了细胞膜蛋白和其相关受体，保证了细胞的生理功能和更强的功能特性。将通过本专利技术得到的细胞膜性贴片直接贴敷于心梗的病灶部位，使细胞100％保留在病灶处，通过细胞旁分泌的作用，促进新生血管生成，改善缺血，提高心脏功能。附图说明图1为细胞在37℃时疏水状，贴壁生长示意图；图2为细胞在20℃时亲水状，细胞解离悬浮示意图；图3为CDC细胞贴片示意图；图4为CDC细胞膜性贴片示意图；图5为CDC细胞培养示意图；图6为心脏组织块原代培养示意图；图7为显微镜下的CDC细胞培养图片图；具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将列举具体实施例进行详细描述。本专利技术制备的人心肌球源性干细胞cardiosphere-derivedcells(CDCs)是将心肌球转移至经过纤维粘连蛋白包被预处理的培养瓶或培养皿中再进行贴壁培养而形成的单层细胞。CDC细胞经流式细胞仪细胞表面标记检测，大多数的细胞表达CD105、CD166、CD90、c-kit、CD34、CD31、而不表达CD45、CD133、造血特异表达蛋白；细胞膜性贴片技术，是用特殊处理过的培养皿，将扩增融合的细胞通过温度的改变从培养皿底壁分离而获得完整膜性贴片状细胞结构的一种技术。与传统酶消化收集细胞的方法相比，用膜性贴片技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。细胞膜性贴片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密细胞膜性贴片组织，能100％将细胞保留在病灶组织部位，有效地修复组织缺损和改善器官功能；温度敏感型培养皿主要由温度敏感材料聚N-异丙基丙烯酰胺(polyN-isopropylacrylamide，PIPAAm)经过特殊处理后使其结合在培养皿底面，由于其表面分子链上同时具有亲水性基团酰胺基(-CONH-)和疏水性的异丙基[-CH(CH3)2-]，当温度敏感培养皿在37℃细胞培养时皿中的材料为疏水性，细胞处于正常贴壁状态(如图1所示)，当温度敏感培养皿离开37℃培养温度至20℃时(如图2所示)，温度敏感培养皿中的敏感材料变为亲水性，温度变化时贴附于培养皿底部的细胞即可自动脱壁卷起，并依靠其细胞自身分泌的细胞外基质extracellularmatrix(ECM)而形成具有二维结构的完整的膜性细胞片。实施例一：心脏细胞培养组织处理：心脏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤a、心脏组织处理：/n心脏组织在无菌条件下剪切并用胰蛋白酶消化，将消化后的心脏组织再次进行无菌剪切后接种于细胞培养皿中，加入少量CEM培养基，细胞培养箱中培养24小时后补充CEM培养基，之后每两天进行换液；/n步骤b、心肌球培养：/n将所述步骤a中的心脏组织进行7-10天的培养，用胰蛋白酶消化心脏组织来源原代细胞，将所述细胞密度调整为1×10

【技术特征摘要】
1.温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、心脏组织处理：
心脏组织在无菌条件下剪切并用胰蛋白酶消化，将消化后的心脏组织再次进行无菌剪切后接种于细胞培养皿中，加入少量CEM培养基，细胞培养箱中培养24小时后补充CEM培养基，之后每两天进行换液；
步骤b、心肌球培养：
将所述步骤a中的心脏组织进行7-10天的培养，用胰蛋白酶消化心脏组织来源原代细胞，将所述细胞密度调整为1×105/ml后接种于24孔板中，每孔300uL，培养3-7天得到心肌球；
步骤c、心肌球的收集与接种：
用培养基反复轻轻吹打使心肌球悬浮，收集于离心管中离心，将收获的心肌球接种于细胞培养瓶中；
步骤d、CDC细胞的收集与保存：
接种于所述细胞培养瓶中的心肌球贴壁后会逐渐向周围爬出大量的CDC细胞，当CDC细胞生长达到80％-90％融合率后即可进行细胞传代，传代后的CDC细胞(P1)冻存于液氮中；
步骤e、CDC心脏膜性贴片制备：
将步骤d收集到的CDC细胞经消化酶消化，按照2×106个-3×108个/ml细胞的浓度将CDC细胞接种于温度敏感培养皿，在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；
步骤f、CDC心脏膜性贴片获取：
将所述步骤e培养得到的接种CDC细胞的温度敏感培养皿，在超净工作台中吸弃培养基，加入4℃预冷的膜性贴片清洗液a，将完全剥离温度敏感培养皿的CDC细胞膜性贴片移至普通培养皿中；
步骤g、CDC心脏膜性贴片再培养：
将所述步骤f中得到的CDC细胞膜性贴片在普通培养皿中滴加200μl-500μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养，取出后加入膜性贴片清洗液b洗膜性贴片n次，n≥2。


2.根据权利要求1所述的温度敏感培养皿制备人心肌球源性干...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嵘，张华军，吴远斌，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11