一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种mRNA疫苗递送载体，所述mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2‑环氧十二烷反应制得。本发明专利技术还提供了该mRNA疫苗递送载体的制备方法。本发明专利技术提供的mRNA疫苗递送载体特异性好、稳定性好、效率高、毒性低、安全有效。

A mRNA vaccine delivery vector and its preparation

The invention provides a mRNA vaccine delivery vector, the mRNA vaccine delivery vector is a lipid polymer, the lipid polymer is prepared by the reaction of PAMAM dendrimer and 1,2 \u2011 epoxy dodecane. The invention also provides a preparation method of the mRNA vaccine delivery carrier. The mRNA vaccine delivery vector provided by the invention has good specificity, good stability, high efficiency, low toxicity, safety and effectiveness.

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法。
技术介绍
近年来，包括肿瘤疫苗在内的肿瘤免疫疗法在改变肿瘤治疗和肿瘤生物学的方面取得了突破。治疗性疫苗在治疗多种类型的肿瘤和传染病方面显示出巨大的潜力。在肿瘤疫苗的发展中，抗原通常以蛋白质多肽和DNA质粒的形式作为疫苗的主要组成部分被用作传统疫苗的开发；而今，基于mRNA(messengerRNA，信使RNA)形式的抗原的疫苗治疗方法也逐步得到应用，并成为常规疫苗策略的有力替代品。多肽抗原合成成本较高，耗时较长；而DNA抗原表达效率不高，而且有造成基因突变的风险。而mRNA形式的抗原不仅可以在非分裂以及难以转染的细胞如树突状细胞中实现快速的蛋白质表达，并且其免疫原性可以通过化学修饰调节。由于以mRNA为基础的疫苗具有作用高效快速、安全性高以及制备成本较低等特点，因此与基于蛋白短肽和质粒DNA的疫苗相比具有更大的发展潜力与优势。目前，在许多基础研究和临床试验中，mRNA疫苗的细胞内递送已显示出可诱导编码抗原蛋白质合成和加工递呈并激活T细胞，从而发挥高效率的抗肿瘤免疫反应的作用。在过去几年中，体外转录mRNA已成为用于递送遗传信息的潜在新型药物。无修饰及递送载体的裸露mRNA注射具有快速且成本低的特点，但由于mRNA自身带高负电荷、易降解、稳定性差等特点，mRNA的体内递送仍面临若干潜在挑战。目前主要的mRNA体内递送手段是利用鱼精蛋白或者纳米脂质体来提高mRNA的稳定性和刺激抗原的提呈。然而鱼精蛋白包裹mRNA还没有用于肿瘤疫苗，其用于治疗自身免疫疾病的产品目前正在临床试验；而纳米脂质体用于mRNA肿瘤疫苗体内递送需要淋巴结注射，对临床操作难度较高，其治疗效果也还有待临床试验的验证。因此，mRNA肿瘤疫苗的临床应用前景虽然光明，但是如何稳定安全的实现mRNA疫苗在体内的表达和激活免疫反应仍然是一个技术难题。有效的mRNA肿瘤疫苗需要克服稳定性差、效率有限、毒性高和成本高等问题，实现mRNA的有效递送及编码抗原的高效表达，从而引起特异性的抗肿瘤免疫反应。作为一种全新的治疗方法，肿瘤纳米疫苗的一个优势是可以实现同时递送肿瘤抗原及免疫佐剂。随着纳米医学的发展，许多纳米工程制剂，包括基于聚合物的纳米材料和基于脂质体的纳米材料，已经设计用于在体内递送siRNA(smallinterferingRNA，小干扰RNA)或其他小寡核苷酸，但用于mRNA疫苗递送的材料还非常有限。由于mRNA的结构及自身物理化学特征，现有的纳米材料对于mRNA递送仍不够有效，以mRNA为基础的肿瘤疫苗的发展与临床应用仍面临许多问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够稳定性好、效率高、毒性低、安全有效的mRNA疫苗递送载体。本专利技术的另一个目的是提供所述mRNA疫苗递送载体的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供一种mRNA疫苗。本专利技术的另一个目的是提供所述mRNA疫苗的制备方法。为此，本专利技术提供了一种mRNA疫苗递送载体，该mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物(poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers)与1,2-环氧十二烷反应制得。优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。本专利技术还提供了所述mRNA疫苗递送载体的制备方法，包括以下步骤：将PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷分别以1：5的摩尔比混合，加入甲醇，油浴加热，反应温度为90℃，反应48h；反应结束后，旋蒸后得油状混合物，即为所述类脂聚合物。本专利技术还提供了类脂聚合物作为mRNA疫苗递送载体的用途，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。一种mRNA疫苗，该mRNA疫苗包括类脂聚合物、编码特定抗原的mRNA和稳定剂，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物(poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers)与1,2-环氧十二烷反应制得。优选地，所述类脂聚合物与mRNA的质量比为160：1，且所述类脂聚合物与稳定剂的质量比为5：1。优选地，所述mRNA编码肿瘤抗原。优选地，所述稳定剂包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)。优选地，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。更优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。本专利技术还提供了所述mRNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将所述类脂聚合物溶于DMSO(二甲基亚砜)中，浓度为10mg/ml，加热至70℃待其完全溶解至透明澄清状态；步骤2：依次加入所述类脂聚合物、所述mRNA和所述稳定剂，溶剂为DMSO，涡旋混匀；步骤3：混匀后，将所述步骤2的混合物按DMSO与水为1:9的比例滴加相应体积的无菌水中，滴加完毕后涡旋混匀；步骤4：静置10分钟，超滤去除DMSO，超滤时用无菌水进行洗涤，超滤后剩余液体即为所述mRNA疫苗。优选地，所述超滤使用孔径为100kDa的超滤管进行。优选地，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物(poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers)与1,2-环氧十二烷反应制得。更优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。本专利技术针对mRNA肿瘤疫苗中mRNA递送效率低、蛋白表达低等问题，以激活免疫细胞的强度为指标，从15种以PAMAM枝状物为骨架并且在支链上做了特别修饰的类脂聚合物中筛选出一种类脂聚合物(代号为C1)作为mRNA疫苗递送载体；并且以这种类脂聚合物C1和表达肿瘤抗原的mRNA分子结合形成mRNA纳米肿瘤疫苗；这种疫苗在细胞和动物体内高效地表达抗原，并且可以激活免疫细胞表面受体来刺激抗肿瘤免疫反应，针对肿瘤特异性抗原诱导机体产生特异性免疫应答，从而达到杀伤肿瘤的作用。本专利技术通过研究证实C1-mRNA纳米疫苗在体外实验中显示出高效的mRNA递送能力、mRNA编码抗原表达及激活T细胞的作用，并且可以通过TLR4介导的分子通路激活抗原提呈细胞，通过诱导特异性免疫应答有效抑制体内多种类型肿瘤的生长。附图说明图1是类脂聚合物C1的合成反应原理示意图。图2是C1-mRNA纳米疫苗的理化表征示意图。图3是基于T细胞激活实验的mRNA疫苗载体的体外筛选。图4是C1-mRNA纳米疫苗在DC2.4细胞及原代细胞BMDCs中的递送效果验证结果。图5是C1-mRNA纳米疫苗在体内的免疫刺激作用。图6是C1-mRNA纳米疫苗在MC38-OVA肿瘤模型中的预防效果。具体实施方式下面结合附本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种mRNA疫苗递送载体，所述mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，其特征在于，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。/n

【技术特征摘要】
1.一种mRNA疫苗递送载体，所述mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，其特征在于，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。


2.根据权利要求1所述的mRNA疫苗递送载体，其特征在于，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。


3.根据权利要求1或2所述mRNA疫苗递送载体的制备方法，包括以下步骤：
将PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷分别以1：5的摩尔比混合，加入甲醇，油浴加热，反应温度为90℃，反应48h；反应结束后，旋蒸后得油状混合物，即为所述类脂聚合物。


4.类脂聚合物作为mRNA疫苗递送载体的用途，其特征在于，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。


5.一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括权利要求1至3任一项所述的mRNA疫苗递送载体、编码特定抗原的mRNA和稳定剂。


6.根据权利要求5所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述类...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小俊，张红侠，吴钧，游欣如，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：广东;44