mRNA疫苗及其试剂盒、应用制造技术

本发明专利技术涉及mRNA疫苗及其试剂盒、应用，mRNA疫苗由隔开的Kras的表位抗原基因序列，和Survivin的表位抗原基因序列，和CEA的表位抗原序列制备得到，试剂盒中包括本发明专利技术的mRNA疫苗，和PD‑1抗体。本发明专利技术的抗体可以用于制备诸如直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肾癌、白血病、肺癌、白淋巴瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤和前列腺癌的药物。本发明专利技术首次把KRas、Survivin和CEA这3个“不可成药”靶点的表位抗原联合在一起制备出mRNA疫苗，达到抑制肿瘤生长的目的。

MRNA vaccine and its kit, application

The invention relates to a mRNA vaccine, a kit and an application thereof. The mRNA vaccine is prepared by isolating the epitope antigen gene sequence of KRAS, the epitope antigen gene sequence of Survivin and the epitope antigen sequence of CEA. The kit includes the mRNA vaccine and the PD \u2011 1 antibody of the invention. The antibody of the invention can be used for preparing drugs such as rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, breast cancer, bladder cancer, fibrosarcoma, kidney cancer, leukemia, lung cancer, white lymphoma, lymphoma, melanoma, myeloma, neuroblastoma, plasmacytoma and prostate cancer. In the invention, for the first time, the epitope antigens of the three \non ready to use\ targets of KRAS, survivin and CEA are combined to prepare mRNA vaccine, so as to achieve the purpose of inhibiting tumor growth.

【技术实现步骤摘要】
mRNA疫苗及其试剂盒、应用
本专利技术涉及mRNA疫苗及其试剂盒、应用。
技术介绍
癌症治疗领域尝试许多方法，如肿瘤切除，但切掉之后很快就复发；放化疗法可以把长得快的癌症细胞杀死，但肿瘤也会重新长出来；小分子靶向药物和大分子靶向药物治疗癌症，发生耐药性问题；CAR-T作为一种新的治疗癌症手段，主要在治疗血癌患者中有效；PD-1和PD-L1抗体药物的出现代表免疫治疗的开始，但也只有不到30％的癌症病人能从中受益。因此治疗型mRNA疫苗是一种新型免疫治疗疗法，能够有效抑制肿瘤生长。具体来说mRNA通过纳米脂质颗粒运送到细胞质，运用人体本身的蛋白翻译系统产生抗原，加工成为表位抗原多肽(Epitopes)，这些多肽和MHCClassI或者MHCClassII分子结合，转运到细胞表面，MHCClassI结合的表位抗原与CD8+T细胞相互作用，诱导T细胞细胞毒性应答反应；MHCClassII结合的epitopes与CD4+T细胞相互作用，引发抗原专一的抗体反应，从而达到抑制肿瘤生长的目的。mRNA疫苗在安全性，快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题；不存在DNA疫苗被整合到宿主基因组中并导致基因突变的可能。并且通常生产一种传统流感疫苗需要至少5-6个月的时间，而mRNA疫苗可以实现标准化生产，在10天内生产出所需疫苗。免疫原性方面，mRNA疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，可以传递更多有效抗原，可以一次表达多个抗原，这是传统疫苗所无法比拟的。KRas、Survivin和CEA这三个基因属于肿瘤相关抗原(Tumorassociatedantigens，TAAs)，它们本质上是非突变的自身抗原，存在于正常基因组中。TAAs通常在人体正常细胞中以相对低水平表达的状态存在，而在癌症组织中表现为过度表达。接种以TAAs为靶点的癌症疫苗之后可以激发机体产生针对相应TAAs的免疫反应，主要是通过激活T细胞，达到杀灭和清除表达该TAAs抗原的癌细胞的目的。虽然KRas、Survivin和CEA是已知的癌症基因靶点，但是迄今为止还没有针对这三个癌症基因靶点的小分子或者大分子药物成功批准上市，它们是著名的“不可成药”靶点。很多生物制药公司尝试开发针对KRas的靶向药物，但Kras乃是最难成药靶点之一，所以多年来没有进展。很多现在小分子药物研发的前沿新技术都是以征服Kras为目的，如诱导蛋白降解的PROTAC技术、小分子RNA抑制剂、化学诱导二聚的SMART平台等，但这些技术自身都有很多细节需要时间搞清楚。目前有针对KRas和Survivin这两个靶点的多肽疫苗，但目前还没有成功的利用这些多肽疫苗在临床实验上成功的报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种mRNA疫苗及其试剂盒、应用。本专利技术的mRNA疫苗，由隔开的：Kras的表位抗原基因序列，和Survivin的表位抗原基因序列，和CEA的表位抗原序列制备得到，其中，Kras的表位抗原基因序列选自SEQIDNo：1、2、3、8、10和15中的一个或多个，Survivin的表位抗原基因序列选自SEQIDNo：4、5、11、24、26中的一个或多个，Kras的表位抗原基因序列选自SEQIDNo：6、7、13、19、20中的一个或多个。本专利技术的mRNA疫苗优选由SEQIDNO：1、2、3、4、5、6和7所述的表位抗原基因序列制备得到。本专利技术的mRNA疫苗优选由SEQIDNO：10、11、13、15、19、20和24所述的表位抗原基因序列。进一步的，表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。本专利技术还涉及一种试剂盒，试剂盒中包括：本专利技术的mRNA疫苗，和PD-1抗体。本专利技术的mRNA疫苗可以应用于制备肿瘤药物，所述的肿瘤具体为直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肾癌、白血病、肺癌、白淋巴瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤和前列腺癌。本专利技术第一次把KRas、Survivin和CEA这3个肿瘤相关抗原联合在一起制备出mRNA疫苗，达到抑制肿瘤生长的目的，首次用非传统的新药开发技术针对“不可成药”靶点。附图说明图1为对照组肿瘤生长曲线。图2为对照组Elispot数据。图3为2号疫苗处理组肿瘤生长曲线图4为2号疫苗Epitope专一免疫反应实验图。图5为3号疫苗处理组肿瘤生长曲线。图6为3号疫苗处理组Elispot数据。图7为4号疫苗处理组肿瘤生长曲线。图8为4号疫苗处理组Elispot数据。图9为5号疫苗处理组肿瘤生长曲线。图10为5号疫苗处理组Elispot数据。图11为3号DNA疫苗组预防性模型实验数据。图12为3号普通mRNA疫苗组预防性模型实验数据。图13为3号修饰mRNA疫苗组预防性模型实验数据。图14为经疫苗处理后肿瘤体积归零小鼠在第49天重新接种2种直肠癌细胞(CT26和CEA-CT26癌细胞)和在第77天重新接种H22肝癌细胞实验数据。图15为#3号普通mRNA疫苗组治疗性模型实验数据。图16为#3号修饰mRNA疫苗组治疗性模型实验数据。图17为胰腺癌MuPrime模型肿瘤生长实验数据。图18为胰腺癌MuPrime模型体重实验数据。具体实施方式以下，结合实施例和附图对于本专利技术做进一步说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本专利技术的保护范围。本专利技术及实施例主要涉及以下内容：1)针对KRas、Survivin和CEA分别设计了6个、10个和11个表位抗原(Epitopes),混合后分别克隆到4个载体(每个载体都含有3个靶点)，通过体外转录制备mRNA,经过加帽提高mRNA稳定性,纯化后制备成4个mRNA疫苗。2)CT26鼠源直肠癌细胞只含KRas和Survivin两个基因，为了同时评估三个靶点，我们构建CEA-CT26稳定细胞株，用于建立动物模型实验。3)采用预防型动物模型，把CEA-CT26直肠癌癌细胞和疫苗同时加到雌性Balb/c老鼠,评估疫苗对肿瘤生长抑制效果，癌细胞接种后第40天杀死老鼠，取出脾脏，用单个表位抗原多肽去刺激脾脏细胞，通过Elispot实验筛选27个表位抗原，挑选出14个最佳表位抗原。4)重复预防型动物模型实验，确认疫苗抑制肿瘤生长效率(甚至使肿瘤归零)的疗效，同时选择6个肿瘤归零老鼠在第一次接种后第49天重新接种直肠癌癌细胞，观察到这些老鼠没有结瘤，然后在第77天又一次接种H22肝癌细胞(该细胞含Kras和Survivin这两个靶点)，在第94天发现肿瘤生长抑制率(TumorGrowthInhibition,TGI)达到92.2％，说明癌症疫苗有长期保护功能，对肝癌也会有好的治疗效果。同时评估疫苗治疗型模型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种mRNA疫苗，其特征在由隔开的：/nKras的表位抗原基因序列，和/nSurvivin的表位抗原基因序列，和/nCEA的表位抗原序列/n制备得到，/n其中，Kras的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：1、2、3、8、10和15中的一个或多个，Survivin的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：4、5、11、24、26中的一个或多个，Kras的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：6、7、13、19、20中的一个或多个。/n

【技术特征摘要】
1.一种mRNA疫苗，其特征在由隔开的：
Kras的表位抗原基因序列，和
Survivin的表位抗原基因序列，和
CEA的表位抗原序列
制备得到，
其中，Kras的表位抗原基因序列选自SEQIDNo：1、2、3、8、10和15中的一个或多个，Survivin的表位抗原基因序列选自SEQIDNo：4、5、11、24、26中的一个或多个，Kras的表位抗原基因序列选自SEQIDNo：6、7、13、19、20中的一个或多个。


2.如权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于由SEQIDNO：1、2、3、4、5、6和7所述的表位抗原基因序列制备得到。


3.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晨衍，
申请(专利权)人：太仓美诺恒康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32