骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球制造技术

本发明专利技术公开了骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球，制备方法为：(1)表面修饰氨基的介孔硅球的制备；(2)microRNA的负载；(3)骨髓间充质干细胞膜的制备；(4)将步骤(2)获得的产物与步骤(3)得到的细胞膜混合，通过水浴超声，得到骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球。本发明专利技术的方法制备的骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球生物相容性好，作为microRNA载体，能高效递送microRNA，保护microRNA免受体内RNA酶的降解；且该骨髓间充质细胞膜的包裹赋予材料低免疫原性。

Surface modified amino mesoporous silica spheres coated with microRNA on mesenchymal stem cells

The invention discloses a surface modified amino mesoporous silica ball coated with microRNA by a bone marrow mesenchymal stem cell membrane, and the preparation method is as follows: (1) preparation of surface modified amino mesoporous silica ball; (2) loading of microRNA; (3) preparation of bone marrow mesenchymal stem cell membrane; (4) mixing the product obtained in step (2) with the cell membrane obtained in step (3), and obtaining bone marrow mesenchymal stem fine by water bath ultrasound The surface modified amino mesoporous silica spheres with microRNA coated on the cell membrane. The bone marrow mesenchymal stem cell membrane prepared by the method of the invention has good biocompatibility of the surface modified amino mesoporous silica sphere containing microRNA. As a microRNA carrier, it can efficiently deliver microRNA, protect microRNA from the degradation of RNA enzyme in vivo, and the encapsulation of the bone marrow mesenchymal cell membrane endows the material with low immunogenicity.

【技术实现步骤摘要】
骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球
本专利技术属于基因治疗药物递送载体及制备方法及应用，涉及一种利用骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球及制备方法。
技术介绍
microRNA是一类内源性非编码的单链RNA分子，这些非编码小分子RNA与靶基因mRNA分子的3’端非编码区域(3’UTR)互补配对后，通过降低目标mRNA分子的稳定性和抑制其翻译两种方式对靶基因进行转录后调控。目前，已发现千余种人类microRNA，它们在炎症、发育、凋亡、肿瘤等多种生理病理过程中发挥着重要作用。介孔硅球作为一种无机纳米颗粒，具有较好的生物相容性，对各种温度和有机溶剂具有高稳定性。并且介孔硅球在体内可降解。有优异的生物相容性，较低的免疫原性，已被广泛用于基因、蛋白质等新型药物的递送和其他的治疗应用。有人利用肿瘤细胞膜包裹负载有葡萄糖氧化酶的介孔纳米材料进行肿瘤治疗，具有免疫逃逸和肿瘤靶向的能力。但是，肿瘤细胞膜会引起体内抗肿瘤免疫反应，该材料不适用于非肿瘤类疾病。参考文献：1.Ambros,V.,etal.,ThefunctionsofanimalmicroRNAs.Nature,2004.431(7006),p.350-355.2.Bartel,D.P.,etal.,MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions.Cell,2004.116(2),p.281-297.3.Bartel,D.P.,etal.,MicroRNAs:TargetRecognitionandRegulatoryFunctions.Cell,2009.136(2),p.215-233.4.Shen,D.,etal.,Biphasestratificationapproachtothree-dimensionaldendriticbiodegradablemesoporoussilicananospheres.NanoLett,2014.14(2),923-932.5.刘威.肿瘤细胞膜包覆的纳米材料及其制备方法与应用:中国，201810921815.1[P].2018-12-25.
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球。本专利技术的第二个目的是提供一种骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球的制备方法。本专利技术的技术方案概述如下：骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球的制备方法，包括如下步骤：(1)表面修饰氨基的介孔硅球的制备：a.按比例，将15～30ml，浓度为25wt％的离子型表面活性剂水溶液、0.1～0.3g催化剂和20～40ml水混合；在50～70℃下搅拌1～2小时，得混合液；将8～24mL1-十八烯，2～6mL正硅酸乙酯加入到混合液中，在搅拌下在油浴中保持在45～70℃，搅拌12～16小时，离心，冻干，得到介孔硅球；b.按比例，将20～35mg介孔硅球分散在10～20mL无水乙醇中，水浴超声45～90min；滴入50～200μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，水浴超声45～90min；离心，收集沉淀，用无水乙醇清洗，真空干燥，得到表面修饰氨基的介孔硅球；(2)microRNA的负载：将表面修饰氨基的介孔硅球、microRNA和pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，按质量比(10～50)：1：(80-120)的比例，在30～37℃，400～1000rpm混合5～15min；保存于4℃；(3)骨髓间充质干细胞膜的制备：用含10％牛血清的DMEM低糖培养基将动物骨髓从骨腔冲洗出来，吹打均匀后用40～70μm过滤膜过滤，滤液在含10％牛血清的DMEM低糖培养基培养5-10天，骨髓间充质干细胞贴在培养皿上，用细胞刮刀挂下所述细胞，用含蛋白酶抑制剂低渗缓冲液重悬，超声破碎细胞，离心收集细胞膜，存储于-20℃；(4)按质量比为(3-5)：1的比例，将步骤(2)获得的产物与步骤(3)得到的细胞膜混合，通过水浴超声，得到骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球。离子型表面活性剂优选：十六烷基三甲基氯化铵或十二烷基硫酸钠。催化剂最好是三乙醇胺。含蛋白酶抑制剂低渗缓冲液的配方为：20～30mMTris-HCl，10～20mMKCl，2～5mMMgCl2，1～3mMPMSF蛋白酶抑制剂，余量为水。所述步骤(3)中超声破碎细胞的功率为190-380W，时间为4～10min。步骤(3)中所述离心的离心力为10000～15000×g。步骤(4)中所述水浴超声的频率为30～50kHz，时间为2～5min。上述方法制备的骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球。本专利技术的优点：1、本专利技术使用的骨髓间充质干细胞膜、介孔硅球均具有良好的生物相容性，对机体不会产生毒害作用。2、本专利技术骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球，赋予介孔硅球更好的生物相容性。实现高效递送microRNA的目的。3、骨髓间充质干细胞为正常细胞，利用骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球，不仅可以逃逸免疫系统的清除，也不会引起体内免疫反应，更加安全。附图说明图1为本专利技术合成过程示意图。图2为MSN@NH2和MSCMNP的透射电镜图。图3为MSN@NH2和MSCMNP的粒径。图4为MSN@NH2和MSCMNP的Zeta电势。图5为microRNA在表面修饰氨基的介孔硅球上的吸附曲线图。具体实施方式本专利技术实施例选用microRNA-21或microRNA-Cy3作为microRNA是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但并不对本专利技术作任何限定，采用其它的microRNA也可以用于本专利技术两种microRNA的核糖核苷酸序列如表1所示。表1.PMSF蛋白酶抑制剂购于北京索莱宝科技有限公司(仅为举例，不作限定)下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但并不对本专利技术作任何限制。实施例1骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球的制备方法，包括如下步骤：(1)表面修饰氨基的介孔硅球的制备：a.将20ml，浓度为25wt％的十六烷基三甲基氯化铵水溶液、0.2g三乙醇胺和30ml水混合；在60℃下搅拌1.5小时，得混合液；将16mL1-十八烯，4mL正硅酸乙酯加入到混合液中，在搅拌下在油浴中保持在60℃，搅拌14小时，离心，冻干，得到介孔硅球；b.将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球的制备方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)表面修饰氨基的介孔硅球的制备：/na.按比例，将15～30ml，浓度为25wt％的离子型表面活性剂水溶液、0.1～0.3g催化剂和20～40ml水混合；在50～70℃下搅拌1～2小时，得混合液；将8～24mL 1-十八烯，2～6mL正硅酸乙酯加入到混合液中，在搅拌下在油浴中保持在45～70℃，搅拌12～16小时，离心，冻干，得到介孔硅球；/nb.按比例，将20～35mg介孔硅球分散在10～20mL无水乙醇中，水浴超声45～90min；滴入50～200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，水浴超声45～90min；离心，收集沉淀，用无水乙醇清洗，真空干燥，得到表面修饰氨基的介孔硅球；/n(2)microRNA的负载：/n将表面修饰氨基的介孔硅球、microRNA和pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，按质量比(10～50)：1：(80-120)的比例，在30～37℃，400～1000rpm混合5～15min；保存于4℃；/n(3)骨髓间充质干细胞膜的制备：/n用含10％牛血清的DMEM低糖培养基将动物骨髓从骨腔冲洗出来，吹打均匀后用40～70μm过滤膜过滤，滤液在含10％牛血清的DMEM低糖培养基培养5-10天，骨髓间充质干细胞贴在培养皿上，用细胞刮刀挂下所述细胞，用含蛋白酶抑制剂低渗缓冲液重悬，超声破碎细胞，离心收集细胞膜，存储于-20℃；/n(4)按质量比为(3-5)：1的比例，将步骤(2)获得的产物与步骤(3)得到的细胞膜混合，通过水浴超声，得到骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球。/n...

【技术特征摘要】
1.骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)表面修饰氨基的介孔硅球的制备：
a.按比例，将15～30ml，浓度为25wt％的离子型表面活性剂水溶液、0.1～0.3g催化剂和20～40ml水混合；在50～70℃下搅拌1～2小时，得混合液；将8～24mL1-十八烯，2～6mL正硅酸乙酯加入到混合液中，在搅拌下在油浴中保持在45～70℃，搅拌12～16小时，离心，冻干，得到介孔硅球；
b.按比例，将20～35mg介孔硅球分散在10～20mL无水乙醇中，水浴超声45～90min；滴入50～200μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，水浴超声45～90min；离心，收集沉淀，用无水乙醇清洗，真空干燥，得到表面修饰氨基的介孔硅球；
(2)microRNA的负载：
将表面修饰氨基的介孔硅球、microRNA和pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，按质量比(10～50)：1：(80-120)的比例，在30～37℃，400～1000rpm混合5～15min；保存于4℃；
(3)骨髓间充质干细胞膜的制备：
用含10％牛血清的DMEM低糖培养基将动物骨髓从骨腔冲洗出来，吹打均匀后用40～70μm过滤膜过滤，滤液在含10％牛血清的DMEM低糖培养基培养5-10天，骨髓间充质干细胞贴在培养皿上，用细胞刮刀挂下所述细胞，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：仰大勇，吴维建，姚池，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12