基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法，其首先采集人体肝叶的生物信息，并输入计算机进行高仿生建模；然后通过生物3D打印机，利用水凝胶材料和用于构建人肝叶所需的肝、胆管上皮、血管内皮、平滑肌和成纤维等细胞进行材料单独打印与材料‑细胞混合打印输出，其中血管和胆管中的空洞部分用铸型剂打印；在所有水凝胶材料固化后，通过酶或螯合反应或温控或光照等手段去除血管和胆管中的铸型剂，构造出人工含胆管肝叶中的血管系统和胆管系统，通过血管系统两端的主血管与培养液输送管连接，实现仿生肝叶的血管系统循环供养与气体交换。其实现了仿生肝叶在体内外的长期存活和生物功能。

Tissue engineering bionic liver lobe structure and preparation method based on living cell 3D printing

【技术实现步骤摘要】
基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法
本专利技术属于生物医学工程，特别涉及一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法，即采用生物3D打印的方式，制备出能长期存活和具有生物功能的人工血管化含胆管肝叶。
技术介绍
现有的人工组织通常采用细胞的体外三维培养来制备，只能制备出小体积人工组织。当人工组织的厚度超过2毫米时就会造成组织深部供养障碍，导致人工组织难以长期存活。为解决深部供养障碍的问题，国内外研究者进行了多种不同的探索。例如将细胞接种在多孔支架上并浸泡在培养基中进行培养，使得营养物质能够通过孔道到达细胞处，但是该方法存在一定的局限性：随着细胞的生长，支架中的孔道会被细胞填满而阻塞营养物质的流通，并且该方法所形成的大体积人工组织由于有支架材料的阻隔难以形成如正常组织中的细胞功能集成；另外也有研究者采用能诱导血管长入的水凝胶材料来包裹细胞培养形成大体积人工组织并植入体内，让逐步长入的血管来供养，但是该方法任然存在深部供养障碍的问题，在血管还没有长入深部的时候，深部的细胞就已经因为缺少养分而死亡，难以实现真正的大体积人工组织的长期存活。随着能够打印活细胞的生物3D打印技术的发展，人们开始利用生物3D打印技术来制备各种人工组织，其中就包括人工血管与人工肝组织。生物3D打印人工血管的出现，使得大体积人工组织的深部供养成为可能。现有最先进的生物3D打印人工肝组织主要是：1、杭州捷诺飞公司应用生物3D打印技术，以肝组织解剖学和生理学数据为基础，模拟肝小叶构建三维模型，用人肝干细胞打印具有功能结构的肝单元产品Regenovo3DLiver。打印的肝单元体积为人体肝小叶（高2mm，宽1mm）的10倍，并且可以在实验室条件下存活超过3个月，具有一定的肝叶功能；2、美国Organovo公司生产的微型肝叶产品exVive3D，其只有0.5mm厚、4mm见方。为制造这种结构，打印机叠加了约20层肝组织细胞和肝星状细胞，这是两种主要的肝细胞，另外还同时打印了血管内皮细胞，这些细胞形成管道网向肝细胞供应养分和氧气，使组织得以存活五天以上并具有一定的肝叶功能。其中第一个产品存在使用细胞单一导致的功能不全问题和无血管系统导致的供养距离不足问题。由于血管网构建不完善，导致供养距离太短，所以打印的肝组织都较小（最厚处不超过5mm）。第二个产品存在存活时间较短、力学强度差和血管结构简单（构成细胞单一、网状结构简单）的问题。这两个产品受到血管系统系统和体外供养系统不全的限制，都存在打印的人工肝组织尺寸受限的问题，尺寸受限后就没有办法仿生大体积肝组织所具有的一些功能，比如缺少胆管这一结构，缺少胆汁运输功能。有些公司的产品通过打印时掺入内皮细胞，可能会形成一些管道，但是并不会形成具有血管完全功能（渗透、运输、联通循环）的血管网，这些形成的管道与真正的血管网的功能大相径庭。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法，采用生物3D打印技术来制备人工含胆管肝叶，使之模拟人体肝叶的结构与生物功能，以实现人工含胆管肝叶在体内外的长期存活和生物功能。本专利技术的目的是这样实现的：一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，包括如下步骤：1）建模：采集人体肝叶的生物信息（包括其中血管系统的信息和胆管系统的信息），输入计算机进行仿生建模，模仿肝叶实际组织外观与微环境，表达为多材料、多尺度的肝叶的几何模型；2）配料：准备构建人体肝叶所需的多种细胞，配制适用构建人体肝叶所需的多种细胞的液态可固化水凝胶材料载体，将构建人体肝叶所需的多种细胞按设定的密度分别与相应的液态可固化水凝胶材料载体混合，配制成含细胞的多种生物墨水，每种生物墨水中只包含一种细胞，同时，配制弹力纤维打印材料，以及配制用于胆管管腔成型的第二铸型剂，配制用于血管管腔成型的第一铸型剂；3）3D打印制备肝叶坯体：在组织工程仿生培养器中进行3D打印，将步骤1)建好的模型数据输入生物3D打印机的配套设备中，设置打印程序，将步骤2)中配制的铸型剂、弹力纤维打印材料以及生物墨水分别装载到生物3D打印机，生物3D打印机的多个喷头按照设定的打印程序轮流喷出液滴进行3D打印，其中喷出的各种液滴分别在相应的条件下自动固化，其中，用步骤2）配制的含肝细胞的生物墨水打印肝叶的肝组织，用步骤2）配制的第一铸型剂打印肝叶的血管管腔区域，形成血管管腔成型支撑体，用步骤2）配制的弹力纤维打印材料打印肝叶的血管管壁的弹力纤维层，用步骤2）配制的多种生物墨水分别打印肝叶的血管管壁对应的细胞层，实现肝叶的血管管壁的多层结构打印，形成成纤维细胞-平滑肌细胞-弹力纤维-内皮细胞的血管管壁结构；用步骤2）配制的第二铸型剂打印肝叶的胆管管腔区域，形成胆管管腔成型支撑体，用步骤2）配制的弹力纤维打印材料打印肝叶的胆管管壁的弹力纤维层，用步骤2）配制的多种生物墨水分别打印肝叶的胆管管壁对应的细胞层，实现肝叶的胆管管壁的多层结构打印，形成成纤维细胞-平滑肌细胞-弹力纤维-胆管上皮细胞的胆管管壁结构；打印完成后形成肝叶坯体；4)刻蚀成型：将固化成型的肝叶坯体进行分级刻蚀，根据组织发育的规律，在不同阶段采用不同的手段分别去除肝叶坯体中用于胆管管腔成型的第二铸型剂以及用于血管管腔成型的第一铸型剂，得到成型有胆管系统和血管系统的仿生肝叶。本专利技术采用分级刻蚀，先通过胆管系统早期供养，再通过完善的血管系统后期供养。同时刻蚀较早会造成供养系统没有完全长好，同时刻蚀较晚会造成早期的中心供养不足。5)体外培养：将成型有胆管系统和血管系统的仿生肝叶的主血管与培养液输送管连接进行组织工程培养，实现仿生肝叶的血管系统循环供养与气体交换，完成仿生肝叶的存活与功能化。由于打印组织可能刚打印完强度比较差，需要一定的塑性时间，故可在肝叶外部用第三铸型剂打印辅助塑性区域，形成辅助塑性部，形成辅助塑性体后再采用刻蚀手段去除辅助塑性部，即可得到肝叶坯体。如步骤1）建立的几何模型还包括肝叶外的辅助塑性部，辅助塑性部由第三铸型剂通过3D打印成型后再经刻蚀手段去除，得到肝叶坯体。得到肝叶坯体或即可通过两级刻蚀分别去除血管和胆管中的铸型剂，构造出人工含胆管肝叶中的血管系统和胆管系统。铸型剂去除顺序为第三铸型剂、第二铸型剂、第一铸型剂。即0级刻蚀去除的是第三铸型剂，一级刻蚀去除的是第二铸型剂，二级刻蚀去除的是第一铸型剂。去除第一铸型剂、第二铸型剂、第三铸型剂采用的手段均不相同。铸型剂的去除手段有酶或螯合反应或温控或光照等。打印过程中，用含肝细胞的生物墨水打印肝组织，用含胆管上皮细胞的生物墨水、含平滑肌细胞的生物墨水、含成纤维细胞的生物墨水以及弹力纤维打印材料分别打印胆管管壁的四层环状结构。用含血管内皮细胞的生物墨水、含平滑肌细胞的生物墨水、含成纤维细胞的生物墨水以及弹力纤维打印材料分别打印血管管壁的四层环状结构。用铸型剂打印胆管管腔、血管管腔，使铸型剂作为胆管管腔、血管管腔的成型支撑体。在铸型剂固化后，通过特异性酶、螯合反应、温控或光照等手段去除血管和胆管中的铸型剂，构造出人工含胆管肝叶中的血管系统和胆管系统。本专利技术实现肝叶坯体中含细胞部分的打印可以采用单细胞打印，也可以采用多细胞打印，喷头一次可喷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）建模：采集人体肝叶的生物信息，输入计算机进行仿生建模，建立肝叶的几何模型；2）配料：准备构建人体肝叶所需的多种细胞，配制适用构建人体肝叶所需的多种细胞的液态可固化水凝胶材料载体，将构建人体肝叶所需的多种细胞按设定的密度分别与相应的液态可固化水凝胶材料载体混合，配制成含细胞的多种生物墨水，每种生物墨水中只包含一种细胞，同时，配制弹力纤维打印材料，以及配制用于胆管管腔成型的第二铸型剂，配制用于血管管腔成型的第一铸型剂；3）3D打印制备肝叶坯体：在组织工程仿生培养器中进行3D打印，将步骤 1 )建好的模型数据输入生物3D打印机的配套设备中，设置打印程序，将步骤2 )中配制的铸型剂、弹力纤维打印材料以及生物墨水分别装载到生物3D打印机，生物3D打印机的多个喷头按照设定的打印程序轮流喷出液滴进行3D打印，其中喷出的各种液滴分别在相应的条件下自动固化，其中，用步骤2）配制的含肝细胞的生物墨水打印肝叶的肝组织，用步骤2）配制的第一铸型剂打印肝叶的血管管腔区域，用步骤2）配制的弹力纤维打印材料打印肝叶的血管管壁的弹力纤维层，用步骤2）配制的多种生物墨水分别打印肝叶的血管管壁对应的细胞层，实现肝叶的血管管壁的多层结构打印，用步骤2）配制的第二铸型剂打印肝叶的胆管管腔区域，用步骤2）配制的弹力纤维打印材料打印肝叶的胆管管壁的弹力纤维层，用步骤2）配制的多种生物墨水分别打印肝叶的胆管管壁对应的细胞层，实现肝叶的胆管管壁的多层结构打印，形成肝叶坯体；4 ) 刻蚀成型：分级刻蚀，在不同阶段采用不同的手段分别去除肝叶坯体中用于胆管管腔成型的第二铸型剂以及用于血管管腔成型的第一铸型剂，得到成型有胆管系统和血管系统的仿生肝叶；5 )体外培养：将成型有胆管系统和血管系统的仿生肝叶的主血管与培养液输送管连接进行组织工程培养，实现仿生肝叶的血管系统循环供养与气体交换，完成仿生肝叶的存活与功能化。...

【技术特征摘要】
1.一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）建模：采集人体肝叶的生物信息，输入计算机进行仿生建模，建立肝叶的几何模型；2）配料：准备构建人体肝叶所需的多种细胞，配制适用构建人体肝叶所需的多种细胞的液态可固化水凝胶材料载体，将构建人体肝叶所需的多种细胞按设定的密度分别与相应的液态可固化水凝胶材料载体混合，配制成含细胞的多种生物墨水，每种生物墨水中只包含一种细胞，同时，配制弹力纤维打印材料，以及配制用于胆管管腔成型的第二铸型剂，配制用于血管管腔成型的第一铸型剂；3）3D打印制备肝叶坯体：在组织工程仿生培养器中进行3D打印，将步骤1)建好的模型数据输入生物3D打印机的配套设备中，设置打印程序，将步骤2)中配制的铸型剂、弹力纤维打印材料以及生物墨水分别装载到生物3D打印机，生物3D打印机的多个喷头按照设定的打印程序轮流喷出液滴进行3D打印，其中喷出的各种液滴分别在相应的条件下自动固化，其中，用步骤2）配制的含肝细胞的生物墨水打印肝叶的肝组织，用步骤2）配制的第一铸型剂打印肝叶的血管管腔区域，用步骤2）配制的弹力纤维打印材料打印肝叶的血管管壁的弹力纤维层，用步骤2）配制的多种生物墨水分别打印肝叶的血管管壁对应的细胞层，实现肝叶的血管管壁的多层结构打印，用步骤2）配制的第二铸型剂打印肝叶的胆管管腔区域，用步骤2）配制的弹力纤维打印材料打印肝叶的胆管管壁的弹力纤维层，用步骤2）配制的多种生物墨水分别打印肝叶的胆管管壁对应的细胞层，实现肝叶的胆管管壁的多层结构打印，形成肝叶坯体；4)刻蚀成型：分级刻蚀，在不同阶段采用不同的手段分别去除肝叶坯体中用于胆管管腔成型的第二铸型剂以及用于血管管腔成型的第一铸型剂，得到成型有胆管系统和血管系统的仿生肝叶；5)体外培养：将成型有胆管系统和血管系统的仿生肝叶的主血管与培养液输送管连接进行组织工程培养，实现仿生肝叶的血管系统循环供养与气体交换，完成仿生肝叶的存活与功能化。2.根据权利要求1所述的基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，其特征在于：步骤4）中去除铸型剂的手段有酶或螯合反应或温控或光照。3.根据权利要求1所述的基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，其特征在于：打印过程中，组织工程仿生培养器中承载打印组织的打印平台根据打印的速度缓缓下降，使已固化成型的打印组织浸入培养器中的培养液中，以保持组织中细胞的活性。4.根据权利要求1所述的基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，其特征在于：含细胞的生物墨水中加入促生长细胞因子，不同的细胞加入相应的促生长细胞因子。5.根据权利要求1所述的基于活细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：周强，叶吉星，甘翼搏，李培，王利元，欧阳斌，涂兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50