一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法。本发明专利技术采用羊骨膜组织，通过原料处理、脱细胞、样本消毒等过程，制备获得羊骨膜脱细胞基质引导骨再生膜，以用于修复牙槽骨或颌骨骨缺损的引导骨再生术中。本发明专利技术提供的羊骨膜衍生脱细胞基质引导骨再生膜有效去除了组织中的细胞成分，消除了异种组织的免疫原性，保留了羊骨膜外基质的活性成分，为骨修复提供良好的微环境，促进口腔骨缺损的修复与改建。另外，本发明专利技术制备羊脱细胞骨膜方法的成本低廉，而且对比于其它哺乳动物，羊骨膜材料的厚度与机械性能更加适用于口腔引导骨再生技术的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法
本专利技术属于生物医用材料领域，涉及一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法。
技术介绍
种植修复成为缺失牙患者的首选治疗方案，但种植修复成功的关键是缺失牙局部要有足够的牙槽骨量，然而临床上由于炎症、外伤、废用性萎缩、颌骨肿瘤术后、先天缺牙等因素，存在大量由于种植区可用骨高度或宽度不足而无法常规种植修复的病例。口腔引导骨再生(Guidedboneregeneration,GBR)技术最早来源于牙周手术中的引导组织再生技术(guidedtissueregeneration,GTR)，于20世纪80年代被正式引入种植手术中，沿用至今，取得了显著的临床应用效果。该技术是应用一张生物膜材料在牙槽骨缺损的表面建立并维持一个局部封闭的空间，以阻断外周纤维结缔组织的长入，使骨组织在这个空间里充分完成骨再生与骨改建的过程。口腔引导骨再生技术的成功所依赖的原理是由于不同细胞的迁移速率不尽相同，纤维结缔组织细胞的迁移速率远大于骨细胞。若无生物屏障膜的保护，纤维结缔组织就会优先占领骨缺损的部位，致使骨组织没有空间再生，而生物屏障膜的主要作用就是在成骨的过程中阻挡软组织的侵扰。因此，口腔引导骨再生屏障膜是影响引导骨再生技术成功的关键因素之一。组织衍生细胞外基质材料(extracellularmatrix，ECM)是由同种异体或异种的组织经过脱细胞技术的处理而获得，其基础与应用研究在组织工程与再生医学的研究领域已逐渐成为研究热点。脱细胞组织的细胞外基质支架材料是在有效去除天然组织中具有免疫原性的细胞成分的基础上，最大限度地保留了其天然发生的内部三维支架结构以及结构中的结构蛋白成分(包括胶原蛋白、弹性蛋白等)、特殊蛋白成分(包括纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)、蛋白聚糖成分(包括糖胺多糖、硫酸肝素、软骨素)和各种各样的生长因子成分，这些组织特有的内部结构和天然成分都是人工合成材料所无法完美复制的。骨膜(periosteum)是紧密附着在骨组织表面的、由致密结缔组织构成的一薄层结缔组织纤维膜，具有丰富的血液供应和神经支配，在骨生长和改建过程中发挥重要的作用。它不仅是骨祖细胞和局部成骨因子的重要来源，而且是募集成骨细胞和相关生物因子的天然生物支架。由于骨膜与成骨作用之间存在十分密切的联系，越来越多的学者开始认识到其在骨组织工程研究中的重要价值。目前，大多数相关研究主要关注于如何探索出更先进的生物学材料制备方法，从而模拟出更接近于人体骨膜结构和功能的人工合成骨膜材料，而很少有研究关注天然骨膜组织本身。目前为止，用于口腔引导骨再生屏障膜研究的脱细胞基质材料的组织来源包括人真皮组织、人羊膜组织、牛心包膜组织、猪心包膜组织、鱼皮组织，其中，只有真皮组织已投入临床应用，其余组织衍生的材料仍处于临床前基础研究阶段。另外，有研究报道，尽管组织衍生的脱细胞基质材料常用于非同源解剖位点的修复，位点同源的组织衍生的材料与之相比对组织的修复再生更具优势。基于以上，骨膜组织的细胞外基质材料相比于其他人工合成的骨膜组织工程材料以及其他组织来源的脱细胞基质材料，能够更好的替代自体骨膜组织。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种由羊小腿骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法，本专利技术通过将羊骨膜组织脱细胞处理后制备成细胞外基质膜材料，应用于口腔引导骨再生技术中发挥引导骨再生膜的作用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜，是将新鲜羊小腿骨的骨膜组织经脱细胞处理、样本消毒后制得的。一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜的制备方法，包括以下步骤：(1)取新鲜羊小腿骨的骨膜组织；(2)骨膜组织-80℃冷冻，再37℃解冻；上述冷冻-解冻为1次冻融循环，共进行3次；(3)解冻后的骨膜组织用0.5％～2％(vol/vol)TritonX-100溶液处理4～24h；(4)用0.05％～1％(vol/vol)SDS溶液处理3～6h；(5)置入DNase和RNase的混合溶液，于37℃反应3～6h；(6)用万古霉素、庆大霉素、头孢西丁和两性霉素B的混合溶液于37℃处理12～24h；(7)用0.05％～1％(vol/vol)过氧乙酸溶液处理3～6h；(8)用青霉素和链霉素的PBS溶液荡洗处理，共进行3次，每次不少于12h，得脱细胞骨膜样品；(9)将羊脱细胞骨膜样品无菌分装，用钴60辐照法灭菌后在-80℃保存。进一步地，本专利技术中步骤(3)(4)(5)中每一步试剂处理后，脱细胞样品均经过无菌PBS的充分荡洗。所述的由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜在口腔引导骨再生材料中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下。1.本专利技术脱细胞方法能够有效地去除羊骨膜材料内的细胞成分，而且细胞外基质的主要组成成分——胶原和糖胺聚糖的结构、分布以及含量并没有受到显著的影响，脱细胞骨膜由于微观结构内部的孔隙较新鲜骨膜变大，使得脱细胞骨膜的吸水性增加，而弹性模量降低，但由于胶原的完整性没有受到破坏，所以脱细胞骨膜的最大屈服应力值没有显著的降低，其机械性能并没有受到显著的影响。2.本专利技术羊脱细胞骨膜具有良好的生物相容性，不仅能促进小鼠MC3T3-E1细胞的黏附、增殖与成骨分化，在异种植入时，也并不会引专利技术显的免疫炎性反应。最重要的，可以在口腔引导骨再生技术中发挥有效的促进成骨的作用。附图说明图1为新鲜羊骨膜的剥离过程图。图2为羊骨膜脱细胞前后大体观察图(A：新鲜羊骨膜；B:脱细胞羊骨膜)。图3为羊骨膜脱细胞前后HE染色图(A：新鲜羊骨膜；B:脱细胞羊骨膜)。图4为羊骨膜脱细胞前后扫描电镜观察图(A：新鲜羊骨膜；B:脱细胞羊骨膜)。图5为脱细胞羊骨膜与新鲜羊骨膜的机械性能指标对比。图6为扫描电镜观察小鼠MC3T3-E1细胞于脱细胞骨膜表面细胞黏附的过程图(A：6h；B：24h；C：48h。)。图7为不同时间点时新鲜骨膜组和脱细胞骨膜组皮下植入局部HE染色图。图8为兔颅骨引导骨再生手术过程图。图9为不同时间点时各组Micro-CT的影像图。图10为不同时间点时各组骨缺损边缘甲苯胺蓝染色图(A:对照组；B：单纯植骨组；C：单纯骨膜组；D:植骨+骨膜组)具体实施方式下面结合附图和实施例详细描述本专利技术，以下所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员，在不脱离本专利技术方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本专利技术的保护范围。实施例1多种哺乳动物骨膜对比试验。分别解剖处理牛小腿、猪小腿、羊小腿和兔小腿，得骨膜材料，对上述4中材料进行对比，具体数据见下表。表1多种哺乳动物骨膜对比数据表经过解剖多种哺乳动物(牛、猪、羊、兔)骨膜对比，发现羊骨膜材料不仅来源丰富、解剖过程简单，且其厚度和机械性能更加适合被利用。羊小腿骨膜的厚度适中，与目前临床上应用的商品膜厚度相仿，更适合用在后续的口腔引导骨再生膜的制备过程，然而牛和猪小腿骨膜过厚，兔小腿骨膜厚度过薄；另外，从机械性能的角度分析，四种哺乳动物之间的综合机械性能：兔小腿骨膜＜羊小腿骨膜＜猪小腿骨膜＜牛小腿骨膜，兔小腿骨膜的强度过低，无法支持后续口腔引导骨再生膜的制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜，其特征在于，所述由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜是将新鲜羊小腿骨的骨膜组织经脱细胞处理、样本消毒后制得的。

【技术特征摘要】
1.一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜，其特征在于，所述由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜是将新鲜羊小腿骨的骨膜组织经脱细胞处理、样本消毒后制得的。2.一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取新鲜羊小腿骨的骨膜组织；（2）骨膜组织-80℃冷冻，再37℃解冻；上述冷冻-解冻为1次冻融循环，共进行3次；（3）解冻后的骨膜组织用0.5%~2%（vol/vol）TritonX-100溶液处理4~24h；（4）用0.05%~1%（vol/vol）SDS溶液处理3~6h；（5）置入DNase和RNase的混合溶液，于37℃反应3~6h；（6）用万古霉素、庆大霉素、头孢西丁和两性霉素B的混合溶液于37℃处理12~24h；（7）用0.05%~1%（vol/vol）过氧乙酸溶液处理3~6h；（8）用青霉素和链霉素的PBS溶液荡洗处理，共进行3次，每次不少于12h，得脱细胞骨膜样品；（9）将羊脱细胞骨膜样品无菌分装，用钴60辐照法灭菌后在-80℃保存。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述新鲜羊小腿骨的骨膜组织为候选区内完整的骨膜组织。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，骨膜组织-80℃冷冻时间至少为6h，再37℃解冻30min。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，DNase和RNase的混合溶液是100U/mL的DNase和75μg/mL的RNase的混合溶液。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中，所述混合溶液是50mg/L的万古霉素、8mg/L的庆大霉素、240mg/L的头孢西丁和25mg/L的两性霉素B的PBS混合溶液。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中，所述过氧乙酸溶液为中性，pH=7.3。...

【专利技术属性】
技术研发人员：敖强，何晶，陶美含，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21