诺如病毒S颗粒类疫苗及其制备和使用方法技术

本文公开了疫苗组合物，特别是用于抗原呈递的多价二十面体组合物。所公开的组合物可含有由重组融合蛋白组成的S颗粒。重组融合蛋白可包括诺罗病毒(NoV)S结构域蛋白、可操作地连接到诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域、和可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。

Norovirus s particle vaccine and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诺如病毒S颗粒类疫苗及其制备和使用方法交叉引用相关申请本申请要求2017年3月28日提交的美国临时申请62/477,481的优先权和权益，其内容以其全部并入并且用于所有目的。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的R21AI092434-01A1和R56AI114831-01A1至XJ的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
RV导致严重的急性胃肠炎，主要发生在婴儿和幼儿中，导致每年全球5岁以下儿童中约200,000人死亡、230万人住院以及2400万门诊[25-27]。目前的两种RV疫苗RotaTeq(Merck)和Rotarix(GlaxoSmithKline,GSK)在许多发达国家都能有效地保护儿童免受严重的RV病例[28,29]。然而，它们在非洲和亚洲的大多数发展中国家都没有表现出令人满意的效果[30-32]，其中RV的感染率、发病率和死亡率大多发生，因此大多需要RV疫苗。
技术实现思路
本文公开了疫苗组合物，特别是用于抗原呈递的多价二十面体组合物。所公开的组合物可含有由重组融合蛋白组成的S颗粒。重组融合蛋白可包括诺罗病毒(NoV)S结构域蛋白、可操作地连接到诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域、和可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。所公开的组合物可用于提供附图说明此申请文件至少包含一个彩色绘图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。图1.天然诺罗病毒(NoV)S结构域蛋白以低效率组装成颗粒或复合物。(A)GST-S结构域融合蛋白的表达构建体的示意图，显示凝血酶切割位点和铰链的位置。(B和C)GST-S融合蛋白(GST-S，～51kDa)(B)和游离S蛋白(～25kDa)(C)的SDS-PAGE分析。(D)S蛋白的EM显微照片，显示少量组装的S颗粒(箭头)。(E)通过尺寸排阻柱(Superdex200)对S蛋白进行凝胶过滤色谱的洗脱曲线。通过凝胶过滤校准试剂盒和纯化的重组NoVP颗粒[21,22]、小P颗粒[20]和P二聚体[11]校准凝胶过滤柱。显示蓝色葡聚糖2000(～2000kDa，空隙)、P颗粒(～830kDa)、小P颗粒(～420kDa)、P二聚体(～69kDa)和抑肽酶(～6.5kDa)的洗脱位置。(F)来自两个峰的蛋白质的SDS-PAGE分析，峰1(级分#15和16)和峰2(级分#28和29)。在所有SDSPAGE中，泳道M是具有指定分子量的预染色蛋白质标记物。在(B)、(C)和(F)中分别观察到～42和～16kDa的次要S蛋白条带。图2.鉴定S结构域中暴露的蛋白酶位点。(A)蛋白酶切割的S蛋白的N-末端测序产生五残基序列，NAPGE。(B)S结构域序列显示相同的五残基序列，NAPGE(下划线)，表明了蛋白酶切割位点(星号)。显示了C-末端铰链(下划线)、四残基接头(GGGG)和末端融合的Hisx6肽。还显示了该重组S结构域蛋白的计算的分子量。(C)所有GII诺如病毒的表示之间的序列比对表明蛋白酶位点是高度保守的(突出显示位置69和70)。(D)在3倍轴上以不同颜色的卡通表示检查部分GIINoV壳结构(W.J.，未发表的数据)显示由球形表示中的R69(红色)-N70(青色)形成的暴露的蛋白酶位点。左图：俯视图；右图：侧视图。图3.SR69A蛋白和S60颗粒的生产和表征。(A)SR69A蛋白的表达构建体的示意图，显示铰链、接头(GGGG)和Hisx6肽(标记为H的橙色球)。其完整序列显示在图2B中。(B)SR69A蛋白(～25kDa)的SDS-PAGE分析。泳道1至5是来自TALONCellThru树脂的洗脱级分。泳道M代表具有指定分子量的预染色蛋白质标记物。(C)SR69A蛋白的EM显微照片，显示统一尺寸的自组装S60颗粒。(D和E)通过凝胶过滤色谱法(D)分析SR69A蛋白质，然后对洗脱峰(E)进行SDSPAGE分析。(D)通过尺寸排阻柱(Superdex200，10/300GL)对SR69A蛋白质的凝胶过滤色谱的洗脱曲线。如图1E中所述校准凝胶过滤柱。蓝色葡聚糖2000(～2000kDa)、P颗粒(～830kDa)、P二聚体(～69kDa)和抑肽酶(～6.5kDa)的洗脱位置分别由(x)和1、2、3和4表示。(E)凝胶过滤(D)中三个主峰的SR69A蛋白的SDS-PAGE分析，其中泳道C在加载到尺寸排阻柱之前是对照SR69A蛋白；泳道M是具有指定分子量的预染色蛋白质标记物；泳道8和9来自峰1的级分#8和9，泳道16来自峰2的级分#16；泳道19来自峰3的级分#19。(F)SR69A蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。对于80μMSR69A蛋白(基于单体)的乙酸铵水溶液(200mM，pH6.8和25℃)以阳离子模式获得的ESI-MS。检测到SR69A结构域单体(25.047kDa)和二聚体(50.095kDa)。观察到以m/z～15,500为中心的宽特征。尽管质量分辨率不足以建立电荷状态，但是基于报道的大蛋白质复合物的m/z[61]估计这些离子的MW约为1.47MDa，对应于60价S60颗粒的MW。图4.基于60价猫杯状病毒VLP的已知晶体结构(PDB#：4PB6)的S60颗粒的结构建模。(A)显示S60颗粒的EM显微照片。(B至D)表面表示中卡通表示(B)中的SR69A蛋白单体(橙色)和五(C)和两倍(D)轴上的S60颗粒的结构。暴露的C端铰链(表面表示)以绿色显示。(E至G)在表面表示中分别地，具有C-末端稠合的接头(品红色)和Hisx6肽(天蓝色)在点图示(E)中的SR69A蛋白单体(橙色)以及得到的S60颗粒在五(F)和两倍(G)轴上的结构。暴露的C-末端铰链、接头和Hisx6肽以点表示显示。图5.表征S60-VP8嵌合颗粒。(A)SR69A-VP8嵌合蛋白的示意图。轮状病毒的VP8抗原(绿色)通过接头(HHHH)与铰链融合。将Hisx6肽(橙色)与VP8抗原的C末端融合。(B)SR69A-VP8蛋白(～45kDa)的SDS-PAGE分析。(C)通过尺寸排阻柱(Superdex200,10/300GL)对SR69A-VP8蛋白进行凝胶过滤色谱。如图1E所示校准所述柱。蓝色葡聚糖2000(～2000kDa)、P颗粒(～830kDa)、P二聚体(～69kDa)和抑肽酶(～6.5kDa)的洗脱位置分别用标记为1、2、3和4的(x)表示。(D)来自凝胶过滤(C)的峰1的S60-VP8颗粒的EM显微照片。(E)SR69A-VP8蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。对于80μMSR69A-VP8蛋白(基于单体)的乙酸铵水溶液(200mM，pH6.8和25℃)以阳离子模式获得的ESI-MS。检测到SR69A-VP8单体(44.950kDa)和降解产物(19.990kDa)。观察到以m/z～23,700为中心的宽特征。虽然质量分辨率不足以确定电荷状态，但这些离子的MW根据报道的大蛋白复合物的m/z[61]估算约为3.4MDa，相当于60价SR69A-VP8颗粒的MW。图6.通过引入S结构域间二硫键进一步稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于抗原呈递的多价二十面体组合物，其包含S颗粒，其中所述S颗粒包含重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含a)诺罗病毒(NoV)S结构域蛋白；b)可操作地连接到所述诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域；和c)可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.28 US 62/477,4811.一种用于抗原呈递的多价二十面体组合物，其包含S颗粒，其中所述S颗粒包含重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含a)诺罗病毒(NoV)S结构域蛋白；b)可操作地连接到所述诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域；和c)可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。2.根据权利要求1所述的多价二十面体组合物，其中所述组合物具有二十面体对称结构。3.根据权利要求1或2所述的多价二十面体组合物，其中所述组合物包含60个抗原呈递位点。4.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白质包含所述NoVS结构域蛋白的蛋白酶切割位点中的突变，其中所述突变使得所述位点对胰蛋白酶切割具有抗性。5.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变位于第69位或第70位，并且其中所述突变使所述位点对胰蛋白酶切割具有抗性。6.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺如病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变发生在位置R69，优选地其中所述突变是足以破坏蛋白酶切割位点的K以外的任何氨基酸，更优选地其中所述突变是R69A。7.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺如病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变发生在位置N70，优选地其中所述突变是足以破坏蛋白酶切割位点的P以外的任何氨基酸。8.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含足以提供非天然二硫键结合位点的突变。9.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含在空间上彼此接近的至少两个氨基酸至半胱氨酸残基的突变，其足以在多价二十面体S颗粒的相邻S结构域蛋白之间提供至少一个非天然二硫键结合位点，或者至少两个非天然二硫键结合位点，或至少三个非天然二硫键结合位点。10.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含足以提供至少一个非天然二硫键形成位点的突变，其中所述突变选自V57C、Q58C、S136C、M140C或其组合。11.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白是杯状病毒的蛋白质，其中所述杯状病毒的特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·谭，X·J·姜，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，
类型：发明
国别省市：美国,US